靶點(diǎn)灌注臭氧治療慢性骨髓炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性骨髓炎一直是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的頑疾之一，被喻為“第二癌癥”。盡管新一代抗菌藥物抗菌活性不斷提升，手術(shù)干預(yù)手段日趨完善，但慢性骨髓炎的復(fù)發(fā)率仍高達(dá)20-30％[1]，部分傷員最終不得不行截肢術(shù)，不僅給患者個(gè)人帶來巨大的身心痛苦，而且給家庭及國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1,2,3]。因此，縮短慢性骨髓炎的治療時(shí)間，提高治愈率，降低致殘率，具有重大的臨床意義和社會(huì)意義。
　　 當(dāng)前治療慢性骨髓炎所形成的共識(shí)是:徹底清創(chuàng)和傷口引流的基礎(chǔ)上給予

2、抗菌藥物治療[3]?？咕幬镓灤┯诼怨撬柩椎闹委熯^程并決定著治療的成敗。近年來，雖然抗菌新藥不斷推出、給藥方式不斷改進(jìn)，但治療效果并不十分理想[4]。病灶內(nèi)游離態(tài)抗菌藥物濃度不足導(dǎo)致治愈率低和復(fù)發(fā)率高等問題始終未能徹底解決。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，具有廣譜高效殺菌作用，近年來的實(shí)驗(yàn)研究表明，適當(dāng)濃度的臭氧還具有殺滅細(xì)菌生物膜、調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激、改善組織微循環(huán)等作用。本課題首先建立靶點(diǎn)灌注臭氧治療兔脛骨慢性骨髓炎模型，利用微透析取樣技術(shù)對(duì)靶

3、組織抗菌藥物—萬古霉素的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，探討臭氧與抗菌藥物的協(xié)同作用關(guān)系;其次，通過測定靶組織IL-6、TNF-α的含量，并通過影像學(xué)、病理學(xué)和微生物學(xué)手段評(píng)估療效，摸索出臭氧局部治療的有效方案。通過本實(shí)驗(yàn)研究，我們?cè)噲D闡明局部應(yīng)用臭氧治療慢性骨髓炎的內(nèi)在作用機(jī)制，從而為慢性骨髓炎的治療開辟新思路與新途徑。
　　 一、目的:
　　 建立兔慢性骨髓炎模型，靜脈給予鹽酸萬古霉素，并在骨組織局部灌注臭氧，采用微透析技術(shù)聯(lián)合

4、反相高效液相色譜(HPLC)同步測定鹽酸萬古霉素在兔骨組織和血液中規(guī)定時(shí)間點(diǎn)的游離藥物濃度，觀察鹽酸萬古霉素在骨組織和血液的藥代動(dòng)力學(xué)變化特點(diǎn)，探討臭氧與抗菌藥物的協(xié)同作用關(guān)系;其次，定量分析骨髓炎病灶部位炎癥因子（IL-6、TNF-α）的變化與臭氧的關(guān)系，初步揭示臭氧抗感染治療的機(jī)制，為臭氧聯(lián)合萬古霉素治療慢性骨髓炎提供依據(jù)。
　　 二、材料和方法:
　　 1、萬古霉素的藥動(dòng)學(xué)研究部分:雄性新西蘭大白兔18只，體重2-

5、2.5Kg，隨機(jī)分為3組，分別為正常組，慢性骨髓炎萬古霉素治療組，臭氧聯(lián)合萬古霉素治療組。實(shí)驗(yàn)前18小時(shí)禁食不禁水。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均經(jīng)兔耳緣靜脈給予鹽酸萬古霉素30mg/Kg，臭氧干預(yù)組在靜注萬古霉素前給予臭氧2ml(40μ g/mL)，采用微透析技術(shù)對(duì)骨組織和血液進(jìn)行同步取樣，聯(lián)合反相高效液相色譜技術(shù)實(shí)時(shí)檢測骨組織和血液中鹽酸萬古霉素的濃度變化，所得藥物濃度數(shù)據(jù)用WinNonlin軟件處理。
　　 2、臭氧抗感染治療的機(jī)制研究:雄

6、性新西蘭大白兔18只，體重2-2.5Kg，隨機(jī)分為3組，分別為正常組，慢性骨髓炎對(duì)照組，慢性骨髓炎臭氧干預(yù)組。臭氧干預(yù)組給予臭氧2ml(40μ g/mL)，采用微透析技術(shù)對(duì)骨組織進(jìn)行取樣，聯(lián)合ELISA法對(duì)樣品中的IL-6、TNF-α進(jìn)行定量分析。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、藥代動(dòng)力學(xué)研究:正常兔血液中的游離萬古霉素濃度在靜注后10min達(dá)峰，為41.5±2.71μg/ml，骨組織也在10min時(shí)到達(dá)峰濃度40.57±

7、2.50μg/ml，兩者濃度在100min前始終保持接近;100min后，血液中的藥物濃度開始高于骨組織，并持續(xù)至觀察點(diǎn)結(jié)束。慢性骨髓炎組病灶部位骨組織中的萬古霉素含量較血液明顯降低，10min達(dá)峰濃度分別43.31±2.67μg/ml（血液），16.35±1.67μg/ml（骨）。臭氧干預(yù)治療后，病灶骨組織的萬古霉素濃度明顯提高，達(dá)到44.37±2.31μg/ml（血液），20.58±4.85μg/ml（骨），但仍低于正常骨組織的藥物

8、濃度。血液、骨組織的藥時(shí)曲線下面積AUC0-inf在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別為:正常組:5280.31±205.73min*μg/ml（血液）和5065.03±209.56min*μg/ml（骨）;慢性骨髓炎萬古霉素治療組:5106.45±205.73min*μg/ml（血液）和1259.53±48.42min*μg/ml（骨）;臭氧聯(lián)合萬古霉素治療組:5353.51±325.58min*μg/ml（血液）和1873.43±573.7min*μg

9、/ml（骨）。
　　 2、炎癥因子變化研究:IL-6、TNF-α在臭氧灌注后均明顯下降，在慢性骨髓炎組，病灶部位IL-6和TNF-α的含量分別為:318.1±2.82pg/ml-361.42±8.52pg/ml，231.48±14.89pg/ml-267.13 pg/ml;臭氧干預(yù)組病灶部位和正常組骨組織的含量分別為79.60±10.12pg/ml-277.16±10.02 pg/ml,59.37±10.57pg/ml-112.

10、06±14.85pg/ml(TNF-α);127.36±13.83pg/ml-371.69±11.97pg/ml,91.91±10.57pg/ml-227.27±17.75pg/ml(IL-6)。
　　 四、結(jié)論:
　　 微透析采樣技術(shù)具有良好的時(shí)間和空間分辨性，聯(lián)合反相高效液相色譜檢測方法可以準(zhǔn)確客觀地反映藥物在慢性骨髓炎病灶組織和血液中的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，是進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究的良好工具。實(shí)驗(yàn)證明，靜脈給藥時(shí)鹽酸萬古霉素具有

11、良好的骨組織穿透性。與血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比，正常骨組織的達(dá)峰濃度及達(dá)峰時(shí)間無差別，但在慢性骨髓炎病灶部位，骨組織中的游離態(tài)藥物濃度顯著低于血漿藥物濃度。臭氧干預(yù)后病灶組織的藥物峰濃度和最低濃度較單純應(yīng)用萬古霉素有所提高，顯示臭氧與萬古霉素間具有協(xié)同作用，該現(xiàn)象可能通過臭氧促進(jìn)糖酵解酶類合成，加快糖代謝，增加NO、CO等物質(zhì)生成，擴(kuò)張微血管，改善局部循環(huán)完成。進(jìn)一步研究顯示臭氧可以調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，顯著降低IL-6、TNF-α等炎癥因子的

12、表達(dá)水平，結(jié)合國內(nèi)外研究，臭氧可通過引起α-synuclein蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的活性，使之不能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制細(xì)胞表達(dá)IL-10、IL-6、TNF-α等炎癥因子。雖然臭氧的協(xié)同作用無法將萬古霉素的骨組織含量提高到正常水平，但可延長萬古霉素在骨組織的駐留時(shí)間，這對(duì)于時(shí)間依賴性的抗菌藥物具有重要意義。同時(shí)臭氧的應(yīng)用可減輕局部慢性炎癥的反復(fù)刺激，有利于炎癥消除，并可抑制破骨細(xì)胞的活性，有利于骨組織重建。綜上所述，病