甜瓜根系分泌物自毒差異基因表達(dá)及根顯微結(jié)構(gòu)變化.pdf

1、自毒作用是甜瓜產(chǎn)生連作障礙的重要原因，根系分泌物是導(dǎo)致這一問題的主要物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)以甜瓜品種‘新銀輝’為材料，利用cDNA-AFLP技術(shù)分析根系分泌物介導(dǎo)的甜瓜化感自毒作用相關(guān)基因的差異表達(dá)，克隆了部分密切相關(guān)基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CmTIP基因及CCCH型鋅指蛋白基因分別導(dǎo)入甜瓜，探討甜瓜根系分泌物介導(dǎo)自毒作用的分子機(jī)理；通過根系分泌物和植株浸提液處理甜瓜幼苗植株，觀察化感自毒物質(zhì)對(duì)根尖顯微結(jié)構(gòu)的直接損害情況；主要研究結(jié)果如下：

2、>　　1.根系分泌物介導(dǎo)的甜瓜自毒作用差異基因表達(dá)情況分析
　　根系分泌物處理甜瓜幼苗植株后提取不同時(shí)期的RNA，采用cDNA-AFLP技術(shù)分析甜瓜自毒相關(guān)基因的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明，63對(duì)引物組合共獲得約1200條TDFs，平均每對(duì)引物組合可擴(kuò)增出15-30條TDFs，長(zhǎng)度在50 bp-750 bp之間。甜瓜自毒相關(guān)基因的表達(dá)模式可分為上調(diào)、下調(diào)、瞬時(shí)和持續(xù)表達(dá)4類。選取表達(dá)差異明顯片段進(jìn)行回收、測(cè)序、比對(duì)，共獲得68條TDF

3、s序列，將其進(jìn)行blastx比對(duì)，結(jié)果顯示其中66條可以找到同源序列。差異TDFs的功能涉及物質(zhì)合成與能量代謝、離子運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程。選取其中6個(gè)TDFs，以甜瓜Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，對(duì)其在不同脅迫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行半定量RT-PCR驗(yàn)證，分析結(jié)果與cDNA-AFLP結(jié)果基本吻合，表明cDNA-AFLP技術(shù)是研究甜瓜化感自毒相關(guān)基因差異表達(dá)的有效方法。
　　2.甜瓜自毒作用密切相關(guān)基因克隆
　　

4、采用RACE和RT-PCR技術(shù)相結(jié)合克隆了三條甜瓜自毒作用相關(guān)基因cDNA全長(zhǎng)，分別為：水通道蛋白基因（CmTIP）、（scarecrow-like protein13-like）SCL13蛋白基因、CCCH型鋅指蛋白基因。甜瓜CmTIP基因cDNA全長(zhǎng)975 bp，包含一個(gè)750 bp的完整閱讀框，編碼250個(gè)氨基酸，具有6個(gè)跨膜區(qū)，2個(gè)高度保守的水孔蛋白基序NPA以及MIP特征序列，GenBank登錄號(hào)：KF134811。甜瓜CmS

5、CL13基因cDNA全長(zhǎng)2170 bp，包含一個(gè)1623 bp的完整閱讀框，編碼541個(gè)氨基酸，該基因具有GRAS家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，GenBank登錄號(hào)：KF134812。甜瓜CCCH型鋅指蛋白基因cDNA全長(zhǎng)2257 bp，包含一個(gè)2061 bp的完整閱讀框，編碼687個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)：KF134813。
　　3.自毒相關(guān)基因?qū)胩鸸霞稗D(zhuǎn)基因植株鑒定
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將實(shí)驗(yàn)中克隆的CmTIP基因及CC