氧化應激介導的喹烯酮遺傳毒性及普洱茶水提取液保護作用研究.pdf

1、獸藥殘留不僅可能影響到畜禽等動物的生長發(fā)育和正常生理機能的維持，而且可能通過食物鏈的生物富集作用影響人類的健康。相關(guān)研究證實人類腫瘤發(fā)病率的升高與許多環(huán)境污染有關(guān)，來自動物食品的某些殘留獸藥的致突變和致癌作用可能是重要的原因之一。喹惡啉類藥物(Quinoxalines)是人工合成的一類具有喹惡啉-l，4-二氧化物（quinoxaline-1，4-dioxides，QdNOs）基本結(jié)構(gòu)的化合物，可抑制多種細菌的生長和繁殖，包括金黃色葡萄球

2、菌、大腸桿菌和沙門氏菌等?？ò脱鹾袜掖甲鳛閮煞N傳統(tǒng)的QdNOs，體內(nèi)和體外的大量研究發(fā)現(xiàn)這兩種藥物存在著潛在的致突變性和致癌性。正因為如此，歐洲共同體委員會(Commission of the European Community，CEC)于1999年將這兩種化學物列為禁止使用的動物促生長劑。然而，作為一種新型的替代產(chǎn)品，喹烯酮（Quinocetone，QCT）與其他QdNOs也存在著相同的主體結(jié)構(gòu)，在大量關(guān)注其藥效的同時，喹烯酮藥物

3、使用的安全性也日益受到人們的關(guān)注。有限的資料顯示，體外研究報道，QCT可能導致細菌和哺乳動物細胞株的致突變作用，并能引起HepG2細胞株的DNA損傷。但是目前關(guān)于QCT在體內(nèi)引起致突變作用的研究很有限，且存在較大爭議，因此選用對致癌性化學物較敏感的實驗動物種群，并結(jié)合短期和長期實驗，對于準確評價喹烯酮對哺乳動物的遺傳毒性評價有重要的科學價值，并為制定相應的使用規(guī)范和標準有參考價值。氧化應激是許多外源化合物導致機體毒性作用的主要早期分子機

4、制之一，有研究證明QdNOs的一些成員如卡巴氧和喹乙醇誘導的DNA損傷與在細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS堆積直接相關(guān)。由于QCT與其他QdNOs一樣具有相同的主體結(jié)構(gòu)，其代謝過程中是否也能引起機體氧化應激，進而導致氧化性DNA損傷，目前還未見報道。
　　 許多研究已經(jīng)證實，應激性反應蛋白的激活是機體應對外源化合物引起毒性作用的早期保護性機制，其中熱休克蛋白家族（heat shock protein，HSP）是當前研究的熱點。在眾多候選基因之

5、中，血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）因具有較強的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，因此與多種氧化應激相關(guān)性損傷密切相關(guān)。正是由于HO-1對氧化損傷的多重防御效應和良好的應激性、可誘導性，近年來它已經(jīng)成為預防氧化損傷的重要靶基因，被廣泛關(guān)注。大量研究發(fā)現(xiàn)，多種膳食抗氧化物能夠誘導HO-1的表達并發(fā)揮抗氧化功能。普洱茶是生長在我國云貴高原特有的茶種，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)普洱茶提取液(BTE)具有較強的抗氧化作用，抗高脂血癥和減

6、肥功能，而發(fā)揮其功能作用的主要機制是能有有效清除體內(nèi)過多的活性氧自由基和活性氮物質(zhì)。提示普洱茶可能通過其強的抗氧化活性，降低外源性毒物引起機體的氧化性DNA損傷，進而發(fā)揮其抗突變作用，但是這一推斷目前尚未在體內(nèi)實驗中證明，此外關(guān)于普洱茶對HO-1的調(diào)節(jié)作用目前還沒有相關(guān)的研究。
　　 因此，為進一步評價喹烯酮在體內(nèi)的遺傳毒性及其分子毒作用機制，本研究通過急性和亞慢性暴露動物染毒，探討氧化應激與遺傳毒性之間的關(guān)系，并研究HO-1在

7、外源性化合物作用下在遺傳毒性中的分子靶點作用。同時，通過普洱茶提取液補充實驗，探索研究BTE對QCT誘導的遺傳毒性的保護作用及其相關(guān)分子機制。
　　 第一部分、急性暴露下喹烯酮對Balb/c小鼠遺傳毒性研究
　　 目的：探討QCT對Balb/c小鼠的致突變作用，并初步探討QCT致突變作用與氧化應激的相互關(guān)系。
　　 方法：雄性Balb/c小鼠（48只）及雌性小鼠（48只），同一性別小鼠隨機分為以下8組：（1）陰性

8、對照組（Control）：0.5％羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃；（2）喹烯酮高劑量組（QCT-H）：12000 mg/kg·bw；（3）喹烯酮中劑量組（QCT-M）：mg/kg·bw；（4）喹烯酮低劑量組（QCT-L）：3000 mg/kg·bw；（5）陽性對照組（CY）：環(huán)磷酰胺40 mg/kg·bw腹腔注射。第二次灌胃4 ~ 6 h頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓涂片，Giemsa染色檢查嗜多染紅細胞(PCE)微核發(fā)生率。取新鮮肝、腎組織，

9、制作單細胞懸液，堿性凝膠電泳實驗評價肝腎分離細胞DNA損傷程度。制作肝、腎組織冰凍切片，DHE染色，熒光顯微鏡下觀察熒光強度，并計算平均熒光密度。制備肝、腎組織線粒體勻漿，檢測GSH水平和總抗氧化能力（T-AOC），以及GPx，SOD和CAT活力。
　　 結(jié)果：
　　 （1）高劑量QCT組雌、雄性Balb/c小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率分別為9.2‰和9.4‰，均顯著性高于陰性對照組。中、低劑量QCT組小鼠微核發(fā)生率與陰性對照

10、組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 （2）彗星實驗結(jié)果顯示急性QCT暴露均可引起B(yǎng)alb/c小鼠肝、腎分離細胞的DNA損傷。對于肝分離細胞，除了3000 mg/kg·bw QCT組，其余QCT劑量組OTM值顯著性高于陰性對照組；對于腎分離細胞，所有QCT劑量組OTM均顯著性高于陰性對照組。
　　 （3）肝、腎細胞中ROS水平呈劑量依賴性升高，同時GSH水平和T-AOC水平在高劑量QCT組線粒體勻漿中顯著性低于對照組，GPx，SO

11、D和CAT活性也受到明顯抑制。
　　 結(jié)論：
　　 （1）喹烯酮急性暴露能夠引起B(yǎng)alb/c小鼠骨髓PCE微核實驗陽性和肝、腎分離細胞DNA損傷程度增加，提示喹烯酮對哺乳動物具有潛在的遺傳毒性。
　　 （2）喹烯酮急性暴露引起的遺傳毒性跟其代謝中產(chǎn)生過多的ROS以及對抗氧化系統(tǒng)的抑制有直接關(guān)系。
　　 第二部分、亞慢性暴露下喹烯酮對SD大鼠遺傳毒性及分子機制研究
　　 目的：以QCT在SD大鼠中的

12、亞慢性暴露造模，以肝臟為主要的靶器官，進一步探討QCT較長時期的暴露對大鼠的遺傳毒性及其分子機制。
　　 方法：成年雄性SD大鼠（160~180 g）72只隨機分為4組：喹烯酮高劑量組(QCT-H):2400 mg/kg/day; 喹烯酮中劑量組(QCT-M):800 mg/kg/day; 喹烯酮低劑量組(QCT-H):50 mg/kg/day；正常對照組(control)：0 mg/kg/day。在喂養(yǎng)期間分別于第5week（

13、8只）和第14 week（10只）處死一批老鼠，分別檢測血清ALT，AST，Cr和BUN水平和尿8-OHdG含量。制備13 week SD大鼠肝細胞懸液，彗星實驗測定肝細胞DNA損傷程度。檢測肝細胞ROS水平以及肝組織勻漿中GSH，MDA含量，GPx，GST，GR，SOD和CAT活性。RT-PCR法檢測堿基切除修復相關(guān)基因OGG1，XRCC1，PARP1，PARP2和PARG mRNA水平。RT-PCR和western blot法分別檢

14、測炎癥相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達水平。同時，分別檢測喹烯酮暴露4 week和13 week SD大鼠肝臟HO-1蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 （1）2400 mg/kg/day 喹烯酮暴露組SD大鼠體重顯著性低于對照組，肝臟相對臟器重量顯著性高于正常對照組。血清生化結(jié)果顯示：QCT染毒大鼠血清ALT，AST水平呈劑量依賴型和時間依賴型升高，且高劑量QCT組大鼠血清ALT和AST水平均顯著性高于對照組（

15、P＜0.05）。此外肝臟病理結(jié)果顯示肝細胞內(nèi)呈現(xiàn)大量空泡樣改變，匯管區(qū)出現(xiàn)單核細胞侵潤和結(jié)締組織增生性改變，可見少量肝細胞壞死和凋亡現(xiàn)象。
　　 （2）彗星結(jié)果顯示高劑量QCT組大鼠肝臟分離細胞DNA損傷程度明顯增加，其OTM和Tail DNA％值顯著性高于對照組（P＜0.01）。
　　 （3）肝細胞內(nèi)ROS，尿8-OHdG和肝組織勻漿MDA水平呈劑量依賴性升高，而抗氧化系統(tǒng)包括GSH水平，GPx，GST，GR，SOD和

16、CAT活力呈劑量依賴性降低。其中高劑量QCT組各個指標與對照組相比，差異均具有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 （4）與對照組相比，QCT亞慢性暴露后OGG1 mRNA表達呈劑量依賴性升高，其中高劑量QCT組大鼠肝臟OGG1 mRNA升至對照組的5.15倍（P＜0.01）。此外，在OGG1介導的堿基切除修復通路相關(guān)酶 mRNA水平，如Xrcc1，PARP1和PARP2 mRNA表達水平均顯著性升高（P＜0.05）。<

17、br>　　 （5）高劑量QCT的亞慢性暴露，可直接造成NF-κB mRNA表達的上升，同時也增加iNOS，TNF-a和 Cox-2多個基因mRNA的表達水平（P＜0.05）。高劑量QCT可造成p53 mRNA水平的顯著性增高，同時casepase-3 mRNA水平顯著性升高（P＜0.05），以及對凋亡反應有一定抑制作用的Bcl-xl mRNA水平一定程度的下降，但是與對照組相比其差異沒有顯著性（P>0.05）。而各個基因蛋白表達水平與

18、mRNA水平相一致。
　　 （6）高劑量組HO-1蛋白水平呈劑量依賴性和時間依賴性降低，其中QCT染毒三個月SD大鼠肝臟中HO-1蛋白水平顯著性低于對照組（P＜0.05），Nrf-2 mRNA水平和蛋白水平也顯著性低于對照組（P＜0.05），而Keap-1蛋白水平在各個組別之間沒有顯著性差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 (1)QCT亞慢性染毒可造成肝細胞DNA損傷程度增加和OGG1修復系統(tǒng)活化，并產(chǎn)生大

19、量的DNA加合物，進一步提示其具有潛在的遺傳毒性。
　　 (2)HO-1的表達抑制造成的細胞內(nèi)高氧化應激可能是QCT誘導的遺傳毒性的重要分子機制。
　　 第三部分、普洱茶水提取液對喹烯酮誘導的遺傳毒性的保護作用及其機制研究
　　 目的：探討普洱茶水提取液對喹烯酮亞慢性暴露所致遺傳的保護作用及其機制。
　　 方法：成年雄性SD大鼠（160~180 g）40只隨機分為5組：喹烯酮染毒組 (QCT)：2400

20、mg/kg/day ; 普洱茶補充高劑量組(QCT+BTE-H):2400 mg/kg/day QCT+1000 mg/kg/day BTE; 普洱茶補充低劑量組(QCT+BTE-L):2400 mg/kg/day QCT+500 mg/kg/day BTE; 正常對照組(control)：正常進食; 普洱茶對照組：1000 mg/kg/day BTE灌胃。所有SD大鼠喂養(yǎng)13周，每周記錄體重和進食量，于13周末處死所有大鼠。分離血清檢

21、測ALT和AST水平，分離整個肝臟計算肝臟相對重量并做病理切片H&E染色。彗星實驗檢測肝細胞DNA損傷程度，高效液相色譜電化學法檢測尿液8-OHdG水平，冰凍切片檢測肝細胞ROS水平，制作組織勻漿檢測GSH和MDA含量，GPx，GST，GR，SOD和CAT活性。RT-PCR法檢測HO-1，iNOS，TNF-a，Cox-2，p53，Bcl-xl和casepase-3 mRNA水平，western blot法檢測HO-1，Nrf-2，Kea

22、p-1，iNOS，NF-κB，Cox-2，Bcl-xl，casepase-3，ERK 42/44和pERK 42/44 (Thr202/Tyr204)蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 （1）喹烯酮染組SD大鼠體重，進食量顯著性低于對照組，肝臟臟器系數(shù)，血清ALT和AST水平顯著性高于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。肝臟病理結(jié)果顯示肝細胞內(nèi)呈現(xiàn)大量空泡樣改變，匯管區(qū)出現(xiàn)單核細胞侵潤和結(jié)締組織增生性改變，可見少量肝細

23、胞壞死和凋亡現(xiàn)象。BTE補充組能在一定程度上改善QCT染毒造成的肝功能損傷，表現(xiàn)為降低血清ALT和AST水平，減輕QCT染毒誘導的肝臟病理損傷。
　　 （2）各個劑量的BTE補充均能夠降低QCT染毒所致的DNA損傷，而BTE本身對肝細胞DNA沒有DNA損傷作用。
　　 （3）各個劑量的BTE補充能提高肝臟中HO-1 mRNA和蛋白水平，并能提高Nrf-2蛋白水平。此外Keap-1蛋白在BTE對照組呈高表達狀態(tài)，而其他各組

24、間的差別不顯著（P>0.05）。
　　 （4）各個組別間ERK42/44蛋白表達水平?jīng)]有明顯差別（P>0.05），但是BTE補充能提高ERK42/44的磷酸化水平。
　　 （5）BTE補充能有效降低QCT染毒引起的高ROS，8-OHdG和MDA狀態(tài)，并能上調(diào)肝臟線粒體抗氧化系統(tǒng)，包括GSH含量，GPx，GST，GR，SOD和CAT活力。
　　 （6）與QCT染毒組相比，BTE補充能夠改善SD大鼠肝臟炎癥反應和細胞