耐輻射奇球菌RecO、RecF原核與真核表達體系的構(gòu)建及抗紫外輻射損傷效應的研究.pdf

1、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的對電離輻射、紫外線、干燥、化學誘變劑和其它一些DNA損傷因子耐受性最強的一類細菌。這種極端抗性被認為是由于D．radiodurans具有一套高效DNA損傷修復系統(tǒng)。在DNA損傷方面，5000 Gyγ射線可以在D.radiodurans每個基因組中產(chǎn)生大約200多個斷裂的DNA雙鏈片段(DNA double-strand breaks，DSBs)，大于3

2、000個斷裂的DNA單鏈片段(DNAsingle-strand breaks，SSBs)和超過1000個堿基損傷位點。在這些DNA損傷當中，DNA雙鏈斷裂對于細胞的生存是最致命的。D.radiodurans可在數(shù)小時內(nèi)把這些DNA損傷全部修復，精確重建基因組并保持活力和性狀的穩(wěn)定。 近年來的研究結(jié)果顯示，D.radiodurans的輻射抗性源于其高效的DNA修復能力，同時電離輻射和紫外輻射產(chǎn)生大量的氧自由基，可間接造成DNA損傷

3、。因此，D．radiodurans超強的輻射抗性可能與其抗氧化能力密切相關。D．radiodurans在長期的進化過程中形成的氧化防御體系，包括酶類和非酶類。它們能清除氧自由基，參與抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控，有效防止自由基所致的DNA損傷，表現(xiàn)出超強抗氧化和耐輻射能力。對D．radiodurans極端抗性和DNA損傷修復機制的研究，將有利于更好的研究腫瘤細胞的發(fā)病機制和尋找抗輻射藥物，并可將其用于輻射污染環(huán)境的修復。 ReeFOR途徑

4、是D．radiodurans同源重組特有的修復途徑。本研究擬選擇參與D．radiodurans重組修復ReeFOR途徑的兩個關鍵基因recO和recF，分別構(gòu)建D．radiodurans RecO租ReeF原核和真核表達體系，觀察目的基因在宿主受到紫外輻射時的防護效應，為后續(xù)紫外生物防護的研究提供實驗依據(jù)。 一、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)RecO和ReeF原核表達體系的建立 1

5、．根據(jù)GenBank收錄的D．radiodurans(Dr)基因序列recO(DR0819)和recF(DR1089)編碼區(qū)，應用Primer5．0分別設計特異性引物，以D．radiodurans基因組為模板，PCR擴增recO和recF全長基因。將得到的PCR片段T-A克隆于pGEM-T載體，測序驗證。 2．將測序驗證的recO和recF連接于表達載體pET30b(+)，轉(zhuǎn)化構(gòu)建的原核表達重組質(zhì)粒pET30b(+)-recO和

6、pET30b(+)-recF至E.coli BL21(DE3)。 3．優(yōu)化RecF、RecO蛋白誘導條件：選擇不同的IPTG濃度、不同的誘導時間及溫度對蛋白表達量的影響，確定蛋白誘導的最佳條件。研究表明，IPTG濃度為0．3 mM，16℃誘導過夜，RecF融合蛋白表達量最高；IPTG濃度為0．1 mM，37℃誘導2～3 h，ReeO融合蛋白表達量最高。 4．接受UVC輻照后E.coli pET30b(+)-recO、E.

7、coli pET30b(+)-recF、E.coli BL21(DE3)和E.coli pET30b(+)的生存率都受到抑制，從接受50 J/cm2 UVC輻照開始E.colipET30b(+)-recF的生存率明顯高于其它三株菌；E.coli pET30b(+)-recO能耐受UVC的輻照劑量顯著低于E.coli pET30b(+)-recF，但明顯高于另外兩株菌。RecF的保護作用強于RecO。 二、轉(zhuǎn)染recO或recF基

8、因的人皮膚成纖維細胞抗UVB損傷效應的研究 1．建立轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞模型：采用胰酶消化法體外分離和培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞(HSF)。在細胞分離后第3天，消化細胞傳代，HE染色觀察成纖維細胞的純度。染色后鏡下可見細胞邊緣清晰，包體呈梭狀或多角形，核仁清晰，胞核凸起明顯。通過測定生長曲線，確定分離后4～7天為其對數(shù)生長期，此階段細胞生長活躍，繁殖旺盛，適合后續(xù)輻照實驗對細胞數(shù)量的要求。 用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的pcDNA3．1-

9、NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3．1-NT-GFPFusion TOPO-recF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)HSF，通過MTT檢測未轉(zhuǎn)染HSF增殖活性變化確定0、30、90、120 mJ/cm2 UVB為實驗劑量。 2．MTT法測定細胞生長曲線：共設4個實驗組(轉(zhuǎn)染recO未輻照組、轉(zhuǎn)染recO輻照組、轉(zhuǎn)染recF未輻照組、轉(zhuǎn)染recF輻照組)和3個對照組(未轉(zhuǎn)染未輻照組、未轉(zhuǎn)染輻照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒輻照組)

10、開展MTT實驗，結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染未輻照組、轉(zhuǎn)染recO未輻照組、轉(zhuǎn)染recF未輻照組生長曲線無顯著性差異。轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細胞增殖活性在接受90 mJ/cm2 UVB輻照后第4天開始恢復，與未轉(zhuǎn)染未輻照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒輻照組有顯著性差異(P<0．05)。盡管接受90 mJ/cm2 UVB輻照后轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細胞增殖活性能在一定程度上恢復，相較于未受輻照的細胞來說被輻照細胞的增殖活性受到強烈抑制

11、。 3．RecF和RecO轉(zhuǎn)染組輻照損傷形態(tài)學比較：未轉(zhuǎn)染HSF接受不同劑量UVB輻照后24 h，細胞表現(xiàn)出不同程度的損傷，以120 mJ/cm2 UVB損傷作用最為強烈。HSF經(jīng)UVB照射30 mJ/cm2后，細胞逐漸變圓，腫脹，細胞出現(xiàn)空泡；照射劑量增加至90 mJ/cm2后細胞碎片和死亡細胞急劇增加。此外，在同一中等UVB輻照劑量下(≥90 mJ/cm2)，隨培養(yǎng)時間的延長，細胞受損程度加重，具有明顯時效關系。未轉(zhuǎn)染未輻照

12、組及轉(zhuǎn)染recO未輻照組和轉(zhuǎn)染recF未輻照組細胞形態(tài)無異。90 mJ/cm2 UVB輻照后轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，以最初的梭形或多角形變?yōu)椴灰?guī)則形狀，胞漿中空泡化明顯，胞間的縫隙增大，但未見明顯的細胞碎片和死亡細胞。該結(jié)果提示轉(zhuǎn)染recO或轉(zhuǎn)染recF能在一定程度上減緩由UVB輻照引發(fā)的HSF凋亡。 5．細胞抗損傷能力檢測：培養(yǎng)液中LDH可作為反映細胞早期損傷比較敏感的指標之一，存在于細胞漿

13、中。當離體培養(yǎng)的細胞受到某些因素刺激時，細胞膜通透性發(fā)生改變LDH可以從細胞中漏出。用選定UVB劑量輻照HSF后在24 h、48 h、72 h三個時相點檢測培養(yǎng)液中LDH濃度。UVB在低劑量時，對未轉(zhuǎn)染組細胞即有損傷作用，引起LDH向細胞外滲透，高劑量時更為明顯。轉(zhuǎn)染recO和recF組LDH含量與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比在UVB照射后24 h無明顯差異(P>0．05)，在照射后48～72 h轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染recF組(P<0．01

14、)和轉(zhuǎn)染recO組(P<0．05)LDH有顯著性差異。 6．細胞抗氧化能力檢測：SOD活力高低可間接反映細胞清除氧自由基的能力，MDA是脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物，其含量的高低間接反映了細胞脂質(zhì)過氧化程度和細胞受自由基攻擊后的損傷程度。體外分離培養(yǎng)HSF在接受30 mJ/cm2 UVB輻照后，細胞存活率和T-SOD的活力呈劑量依賴性的下降，而LDH和MDA的含量呈劑量依賴性升高。輻照后24～72 h，轉(zhuǎn)染recO和recF都能在一定程度

15、上緩解了UVB引起的細胞T-SOD下降，MDA升高，增殖活力下降，提高了HSF細胞清除氧自由基的能力。 7．細胞抗炎能力檢測：在活體皮膚組織中，防御外界刺激主要依靠的人皮膚角化細胞(HKC)能接受外界刺激后開始激活細胞內(nèi)的信號傳遞系統(tǒng)。HKC在受到紫外線刺激后開始分泌IL-1α，間接誘導包括HSF在內(nèi)的多種細胞生成IL-6。TNF-α是誘發(fā)腫瘤和調(diào)控機體免疫反應的關鍵因子，與UVB輻射引起的皮膚損傷、炎癥反應和細胞凋亡等密切相關

16、。本實驗中UVB對未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染recO和recF組細胞中IL-6和TNF-α分泌的結(jié)果表明UVB輻照能促進離體細胞IL-6及TNF-α的分泌增加，分泌量在一定范圍內(nèi)隨照射劑量升高而呈上升趨勢。轉(zhuǎn)染recO和recF后HSF細胞IL-6分泌明顯低于接受同等輻射劑量的未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組。 綜上所述，本研究將D.radiadurans的recF和recO克隆于pET30b(+)表達載體，使其表達處于T7噬菌體強啟動

17、子轉(zhuǎn)錄和翻譯的信號控制之下，IPTG誘導在宿主菌Ecoli BL21(DE3)中高效表達，初步建立了recO和recF表達體系。體外實驗初步驗證了RecO和RecF能提高E.coli對紫外線的抵抗能力。用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的pcDNA3．1-NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3．1-NT-GFP Fusion TOPO-recF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HSF，分別觀察轉(zhuǎn)染HSF抗UVB損傷的效應。結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染HSF

18、中的recF和recO均能增強細胞對氧自由基的清除能力，抑制細胞脂質(zhì)過氧化來緩解UVB對細胞造成的損傷，增加細胞對UVB損傷的抵抗能力。其中轉(zhuǎn)染reeF組細胞的生存率、抗氧化及抗損傷效應明顯強于轉(zhuǎn)染recO組細胞，其具體機制還有待進一步深入研究。 目前國內(nèi)外對D．radiodurans抗輻射效應的研究主要集中在電離輻射損傷。本研究通過構(gòu)建D.radiodurans高效蛋白表達體系；轉(zhuǎn)染recF與recO至人皮膚成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)