表達(dá)IBV S1蛋白抗原表位的含雞源啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫原性檢測.pdf

1、真核表達(dá)載體中表達(dá)外源基因的組件主要包括:(1)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子;(2)轉(zhuǎn)錄、終止信號(hào);(3)加polyA信號(hào);(4)選擇或篩選標(biāo)記。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子具有種屬和組織特異性，其作用在不同來源的細(xì)胞中有很大區(qū)別。為研究啟動(dòng)子對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的影響，構(gòu)建專門適用于雞體內(nèi)進(jìn)行外源基因表達(dá)的真核表達(dá)載體，本試驗(yàn)將真核表達(dá)載體pcDNA3.1和pCIneo的CMV啟動(dòng)子替換為雞β-actin啟動(dòng)子，并對(duì)IBV ZY3株的S1蛋白抗原表位基因進(jìn)

2、行真核表達(dá)。主要試驗(yàn)內(nèi)容有:
　　根據(jù)GenBank中β-actin啟動(dòng)子（登錄號(hào)為:DI038975）的基因序列設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物5'端分別引入適用于克隆至兩種真核質(zhì)粒pcDNA3.1和pCIneo的酶切位點(diǎn)。提取雞淋巴細(xì)胞基因組DNA作為模版，通過PCR擴(kuò)增獲得雞β-actin啟動(dòng)子序列，并用β-actin啟動(dòng)子替換掉pcDNA3.1和pCIneo中的CMV啟動(dòng)子，獲得重組真核表達(dá)載體pcDNA-act和pCIneo-a

3、ct。將EGFP基因克隆至載體的多克隆酶切位點(diǎn)中，獲得含有EGFP報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pcDNA-EGFP，pcDNA-act-EGFP，pCIneo-EGFP和pCIneo-act-EGFP。將4種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，24 h后通過熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染CEF24 h后，pcDNA-act-EGFP和pCIneo-act-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可觀察到熒光，而pcDNA-EGFP和pC

4、Ineo-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中36h后才可見熒光，4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均在5d后達(dá)到最大表達(dá)量。啟動(dòng)子替換后的重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的綠色熒光蛋白的表達(dá)量明顯多于未替換啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒。
　　根據(jù)IBV ZY3株S1蛋白抗原表位基因序列設(shè)計(jì)引物，以含S1蛋白抗原表位基因的質(zhì)粒PMD19-S1為模版擴(kuò)增S1蛋白抗原表位基因，并將其分別亞克隆至啟動(dòng)子替換前后的真核載體中，獲得含S1蛋白抗原表位基因的重組質(zhì)粒pcDNA-S1，pcDNA-a

5、ct-S1，pCIneo-S1和pCIneo-act-S1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中，采用間接免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中S1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示啟動(dòng)子替換后的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中S1蛋白的表達(dá)量明顯多于未替換啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為檢測以上4種真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫原性，將重組質(zhì)粒對(duì)7日齡SPF雛雞進(jìn)行首免，21日齡二免，同時(shí)設(shè)立IBV滅活疫苗組及PBS空白對(duì)照組。采用間接ELISA試驗(yàn)檢測首免后7、14、21、28天的血清中IB

6、V特異性抗體。首免后28天，用IBV ZY3病毒株對(duì)各組進(jìn)行攻毒，統(tǒng)計(jì)發(fā)病和死亡情況，攻毒14天后，處死所有試驗(yàn)雞并觀察和統(tǒng)計(jì)各組的剖解病變情況。結(jié)果顯示:以上4種質(zhì)粒免疫雞的血清中均可檢測到IBV特異性抗體，啟動(dòng)子替換質(zhì)粒組的抗體效價(jià)在首免后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均比啟動(dòng)子未替換質(zhì)粒組高，且差異顯著(P＜0.05); pCIneo-act-S1免疫組的抗體水平在4個(gè)質(zhì)粒免疫組中始終最高，且除一免后2周外，其余時(shí)間點(diǎn)均比滅活疫苗組高;啟動(dòng)子替換質(zhì)