混合型肝細(xì)胞—膽管細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制及臨床意義的研究.pdf

1、[背景及目的]
　　 在多種慢性肝臟疾病情況下，肝細(xì)胞死亡，同時(shí)成熟肝細(xì)胞增殖能力也受到抑制或者衰竭。隱藏于赫令管的干/祖細(xì)胞組分激活。這些細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，擴(kuò)增形成膽管反應(yīng)。膽管反應(yīng)已經(jīng)被證明與炎癥壞死程度和纖維化程度密切相關(guān)。因?yàn)榇蟛糠致愿闻K疾病都是原發(fā)性肝癌的強(qiáng)烈致病因素，目前普遍認(rèn)為肝祖細(xì)胞成分的激活與肝癌發(fā)生關(guān)系密切：肝祖細(xì)胞在慢性肝炎情況下是潛在的癌變靶點(diǎn)；另外，一部分肝臟腫瘤被認(rèn)為起源于肝祖細(xì)胞。肝癌的祖細(xì)胞樣表

2、型提示該腫瘤的祖細(xì)胞起源，并且這一表型常常與較差的預(yù)后存在相關(guān)性。
　　 混合型肝細(xì)胞.膽管細(xì)胞癌(CHC)是一種同時(shí)包含肝細(xì)胞癌(HCC)和膽管細(xì)胞癌(ICC)成分的原發(fā)性肝臟腫瘤。1949年Allen和Lisa提出了CHC的病理分型方法，分別為雙結(jié)節(jié)腫瘤，雙結(jié)節(jié)融合型腫瘤或混合型。世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)起源的不同，將雙結(jié)節(jié)腫瘤排除在混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌診斷之外。
　　 雖然相對(duì)罕見，混合型肝癌仍然由

3、于其獨(dú)特的臨床病理學(xué)特征而吸引了廣泛的關(guān)注。其主要表現(xiàn)為潛在的祖細(xì)胞起源，較強(qiáng)的侵襲性和較差的預(yù)后。目前，祖細(xì)胞相關(guān)的腫瘤表型已經(jīng)在形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)表型的觀察中被證實(shí)。另外，一些臨床特征與生存的相關(guān)性也曾被闡述。但是，其病理學(xué)特征與臨床預(yù)后的關(guān)系目前還沒有被闡明。而且，混合型肝細(xì)胞.膽管細(xì)胞癌具備顯著的細(xì)胞學(xué)異質(zhì)性，為研究祖細(xì)胞與肝癌的發(fā)生提供了良好的模型。
　　 因此，我們首先對(duì)80例肝切除術(shù)混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌病例展開了以

4、祖細(xì)胞相關(guān)特征為重點(diǎn)的臨床病理研究，旨在發(fā)現(xiàn)這些臨床病理特征與臨床治療轉(zhuǎn)歸之間的聯(lián)系。該研究基于常規(guī)的免疫組織化學(xué)技術(shù)，采用精確到特定組織學(xué)結(jié)構(gòu)的先進(jìn)量化方法。我們應(yīng)用高級(jí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將量化的組織學(xué)指標(biāo)和其他臨床病理學(xué)資料以及臨床轉(zhuǎn)歸進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以期探索這些指標(biāo)對(duì)臨床預(yù)后的預(yù)測(cè)意義以及探討影響預(yù)后的可能機(jī)制。隨后，我們建立了一個(gè)原位混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌小鼠模型。并利用比較病理學(xué)的方法與人類混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌進(jìn)行了對(duì)比，從組織學(xué)上

5、驗(yàn)證了該模型的適用性，為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.收集臨床資料和隨訪：我們收集整理了1997年到2003年間80例術(shù)后病理確診為混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌病人的臨床資料。80例自手術(shù)后接受隨訪觀察患者復(fù)發(fā)和生存的情況，隨訪工作截止于2008年7月。
　　 2.組織學(xué)診斷和分析：混合型肝細(xì)胞膽管細(xì)胞癌的組織學(xué)診斷主要依據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。HepParl、K18、K7和K19染色作為輔助診斷

6、指標(biāo)。肝細(xì)胞癌區(qū)域“多中心發(fā)生”特征的群體定義為：(1)至少存在兩個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)，其中一個(gè)表現(xiàn)為高分化腫瘤位于不典型增生結(jié)節(jié)中，呈現(xiàn)“節(jié)中節(jié)”表現(xiàn)；(2)中等或低分化腫瘤結(jié)節(jié)存在高分化的邊緣部分。癌旁組織的肝炎肝纖維化水平采用Ishak提出的系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估。
　　 3.免疫組織化學(xué)及量化評(píng)估：免疫組化染色的評(píng)估主要依靠計(jì)算機(jī)輔助的染色強(qiáng)度分析或主觀評(píng)價(jià)。我們用癌旁組織切片中K7染色的情況來評(píng)估匯管區(qū)的實(shí)質(zhì).間質(zhì)交界處的膽管反應(yīng)，基于其

7、涵蓋肝實(shí)質(zhì)-間質(zhì)界面的比例。K7陽性的中間型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞按照Roskams提出的方法進(jìn)行半定量評(píng)估。OV-6陽性肝細(xì)胞的評(píng)估采用計(jì)算機(jī)輔助計(jì)算肝細(xì)胞OV-6的表達(dá)強(qiáng)度。另外，PCNA被用來評(píng)價(jià)RDCs的增值狀態(tài)。膽管反應(yīng)的增殖指數(shù)(PI-DR)指PCNA陽性細(xì)胞數(shù)與RDCs總數(shù)的比值。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有連續(xù)變量在接受進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前都接受正態(tài)性檢驗(yàn)。用方差分析(多組)或student'st檢驗(yàn)(兩組)進(jìn)行均數(shù)的

8、比較分析，多組間的多重比較用Dunnett’s檢驗(yàn)。對(duì)于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的比較使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。兩組變量的相關(guān)性根據(jù)其數(shù)據(jù)分布類型的不同采用Spearman或Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Mayer法，Log-Rank檢驗(yàn)提供統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多因素分析方面，因變量為正態(tài)分布連續(xù)變量時(shí)，采用多元線性回歸的方法；因變量為兩分類變量時(shí)，使用Logistic風(fēng)險(xiǎn)回歸；當(dāng)因變量為生存指標(biāo)時(shí)，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸

9、。多元回歸采用逐步回歸法，采用回退法篩除無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變量，最大似然法估計(jì)參數(shù)。
　　 5.建立小鼠模型：我們選取P53-/-C57BL/6J小鼠胚肝中的祖細(xì)胞作為可能的腫瘤前體細(xì)胞，分選培養(yǎng)后移植到野生型的C57BL/6J小鼠肝臟。
　　 [結(jié)果]
　　 1.臨床、組織學(xué)以及隨訪數(shù)據(jù)：80例病例中，85％的病人合并HBV感染，55％的病人基礎(chǔ)疾病為HBV感染相關(guān)的肝硬化。70例接受根治切除的病人的總體1、3和5年

10、生存率為74.3％，38.6％和30％，無瘤生存率為41.1％、18.6和10.0％。64例(91.4％)的病人發(fā)生了術(shù)后復(fù)發(fā)。
　　 2.癌旁膽管反應(yīng)的觀察：80例病例的癌旁組織均可見不同程度增強(qiáng)的膽管反應(yīng)(K7-DR)。PI-DR在26.3％的病例中表現(xiàn)出≥50％，提示處于高度的增殖狀態(tài)。
　　 3.癌旁膽管反應(yīng)與轉(zhuǎn)化增殖肝祖細(xì)胞關(guān)系密切：高PI-DR，而不是高K7-DR的病例，具備更多的中間型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞以及更

11、高的肝細(xì)胞OV-6表達(dá)水平。PI-DR還與祖細(xì)胞的數(shù)量以及DR中Bmi-1的表達(dá)成正相關(guān)。進(jìn)一步分析PI-DR與其他臨床病理資料的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)PI-DR與患者手術(shù)時(shí)的年齡，肝纖維化水平以及肝細(xì)胞的增殖抑制程度呈獨(dú)立相關(guān)性。
　　 4.PI-DR與術(shù)后無瘤生存率具有相關(guān)性：在患者總體生存(overallsurvival，OS)的分析中，多因素分析發(fā)現(xiàn)：PI-DR、K7-DR、MO、AFP在腫瘤中的表達(dá)均為總體生存的獨(dú)立預(yù)后因素

12、。而在無瘤生存分析中，發(fā)現(xiàn)MVI和PI-DR是患者無瘤生存的獨(dú)立影響因素。
　　 5.祖細(xì)胞介導(dǎo)的癌旁肝再生模式具有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)：OV-6和AFP在中間型肝細(xì)胞的共定位表達(dá)罕見。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞OV-6和AFP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。以O(shè)V-6表達(dá)和AFP表達(dá)區(qū)分的肝臟再生狀態(tài)與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　 6.PI-DR與混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)多種祖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)存在聯(lián)系。
　　 7.混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌“多中心發(fā)生”

13、特征與癌旁祖細(xì)胞激活關(guān)系密切
　　 8.祖細(xì)胞起始的小鼠混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌模型與人類肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌病理學(xué)上高度相似：(1)具備明確的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞成分；(2)與人類腫瘤相似組織學(xué)表現(xiàn)的中間型區(qū)域；(3)腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞標(biāo)志物；(4)呈浸潤(rùn)性、多灶性生長(zhǎng)；(5)腫瘤細(xì)胞具備高侵襲性。
　　 [討論]
　　 所有的結(jié)果提示：
　　 1.混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌具備顯著的腫瘤異質(zhì)性，

14、可能與其肝祖細(xì)胞起源有關(guān)。
　　 2.在復(fù)雜的肝臟疾病演進(jìn)過程中，與肝臟的修復(fù)方式密切相關(guān)的多樣化的膽管反應(yīng)可共存于同一基礎(chǔ)肝臟疾病情況下。膽管反應(yīng)的增殖狀態(tài)可以部分反映肝祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的活性。
　　 3.膽管反應(yīng)的增殖狀態(tài)可以預(yù)測(cè)混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌的術(shù)后復(fù)發(fā)。以肝實(shí)質(zhì)修復(fù)為目的的祖細(xì)胞激活可能是混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌的重要驅(qū)動(dòng)力。
　　 4.膽管反應(yīng)的增殖狀態(tài)與腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(腫瘤分化和表型)存在密切聯(lián)系