多壁納米碳圈對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的DNA損傷及其機(jī)制研究.pdf

1、[目的] 隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展及納米材料的大量增多,納米技術(shù)的安全性問(wèn)題正引起世界范圍的重點(diǎn)關(guān)注.多壁納米碳圈(MWCNO)是富勒烯(C60)的同素異形體,又稱(chēng)為嵌套的富勒烯(nested fullerenes).本實(shí)驗(yàn)使用的MWCNO是由電弧法制備的直徑在30nm左右納米材料.有研究表明碳納米顆粒進(jìn)入肺部后能轉(zhuǎn)移到心血管系統(tǒng),同時(shí)有人試圖將其用作抗腫瘤等藥物的載體,進(jìn)入血液后可直接接觸并作用于心血管系統(tǒng),因此其安全性研究顯得

2、特別重要.FrankChen等已就MWCNO對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性和基因組學(xué)水平的影響進(jìn)行研究,結(jié)果表明MWCNO可引起一系列與細(xì)胞代謝、凋亡、細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的mRNA水平的改變.但至今未見(jiàn)MWCNO對(duì)心血管系統(tǒng)影響的研究報(bào)道. 磷酸化的組蛋白H2AX(γH2AX)是目前國(guó)內(nèi)外研究細(xì)胞DNA損傷的熱點(diǎn)之一,γH2Ax在DNA損傷的修復(fù)以及DNA損傷位點(diǎn)檢查點(diǎn)蛋白的聚集中發(fā)揮著重要的作用,特別是D

3、NA雙鏈的損傷.許多與染色體結(jié)構(gòu)的維持、保護(hù)、修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)有組織按順序地在DNA損傷位點(diǎn)結(jié)合形成焦點(diǎn)(foci)復(fù)合物,共同完成對(duì)DNA損傷的檢測(cè)和修復(fù),并且在此過(guò)程中根據(jù)損傷程度的不同導(dǎo)致細(xì)胞周期停頓或細(xì)胞凋亡.因此,根據(jù)細(xì)胞在受到DNA損傷尤其是DNA雙鏈斷裂損傷后,在DSBs位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)由γH2AX形成的焦點(diǎn)這一特性,γH2Ax已成為檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷的一個(gè)新的特異性指標(biāo). 體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種納米顆?？梢砸饳C(jī)體產(chǎn)生RO

4、S.目前許多空氣顆粒物(主要為PM<,2.5>、PM<,10>)和超微顆粒(UFPs)造成DNA損傷的研究都集中在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的機(jī)制,認(rèn)為DNA是ROS的主要靶點(diǎn),ROS的產(chǎn)生是空氣中顆粒物質(zhì)引起DNA損傷的重要機(jī)制. 本研究觀察MWCNO是否引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期改變、DNA損傷及其損傷機(jī)制,以評(píng)價(jià)MWCNO潛在的心血管毒性. [方法] 采用體外實(shí)驗(yàn)的方法.用臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察不同濃度(0.2、1、5、2

5、5、50、100、200μg/ml)的MWCNO對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HuvEC)的抑制率,根據(jù)確定的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)設(shè)定本實(shí)驗(yàn)的劑量.用檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡的試劑盒檢測(cè)不同濃度(0.2、1、5 ug/ml)的MWCNO染塵后血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的變化情況.用免疫熒光法觀察不同劑量(同上)的MWCNO染塵后血管內(nèi)皮細(xì)胞中磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)焦點(diǎn)形成情況,比較細(xì)胞核內(nèi)焦點(diǎn)形成的數(shù)量及熒光強(qiáng)度.用DCFH-DA

6、法檢測(cè)不同劑量(同上)的MWCNO染塵后血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況.免疫熒光顯微鏡圖片用Image Pro Plus軟件進(jìn)行γH2AX焦點(diǎn)定量計(jì)數(shù).所有結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析. [結(jié)果] 流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)顯示:1、5μg/ml的MWCNO顯著促進(jìn)了HUVECs細(xì)胞的凋亡,凋亡率與對(duì)照組比較有顯著性差異.細(xì)胞周期檢測(cè)顯示,各濃度MWCNO作用后均未引起明顯的細(xì)胞周期改變,G1、G2、S期細(xì)胞比例與對(duì)照組比較

7、均無(wú)顯著性差異.γH2AX識(shí)別抗體免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了MWCNO對(duì)HUVECs細(xì)胞DNA雙鏈損傷的情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn).MWCNO能誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成,并具有劑量和時(shí)問(wèn)依賴(lài)性,高濃度(5μg/ml)MWCNO誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)數(shù)目最多,熒光強(qiáng)度也最強(qiáng),隨著時(shí)問(wèn)延長(zhǎng)γyH2AX焦點(diǎn)的數(shù)量及強(qiáng)度也隨之增多、增強(qiáng).各濃度MWCNO處理的HUVECs細(xì)胞12h后可引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,各處理組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,處理24h后ROS有所