EFEMP1表達(dá)與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其意義.pdf

1、腫瘤組織微血管的新生在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色，隨著臨床新興出現(xiàn)的血管生抑制劑用于臨床腫瘤的治療，有關(guān)腫瘤血管新生相關(guān)因子的分子生物學(xué)研究日益受到重視。EFEMP1(epidermal growth factor-containing fibulin-likeextracellular matrix proteins)也叫fibulin-3,屬于fibulin基因家族相對(duì)分子質(zhì)量約50×103(kd)蛋白，并被證實(shí)是一個(gè)與血管新生

2、有關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。最初發(fā)現(xiàn)它由于存在R345W突變，沉積于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而刺激VEGF的表達(dá)，引起血管的增生從而導(dǎo)致脈絡(luò)膜黃斑變性疾病，但它在腫瘤中的作用報(bào)道甚少且結(jié)果不一。較早研究結(jié)果顯示，在肺癌組織中，fibulin-3由于啟動(dòng)子甲基化而導(dǎo)致表達(dá)降低，在體外EFEMP1有拮抗腫瘤血管生成作用。隨后有報(bào)道提出，EFEMP1作為血管生成拮抗劑，由于基因異常甲基化而低表達(dá)于乳腺癌組織中，且這種低表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。另

3、一方面，有最新的研究表明，EFEMP1的表達(dá)在體外促進(jìn)了胰腺癌的生長(zhǎng)和VEGF的表達(dá)，導(dǎo)致CD31(+)的微血管數(shù)量增加。鑒于此不相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有學(xué)者提出EFEMP1的表達(dá)可能因不同組織學(xué)起源的腫瘤而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。
　　 子宮頸癌是女性高發(fā)高侵襲性的惡性腫瘤，那么在子宮頸癌組織中EFEMP1的表達(dá)情況如何以及它與腫瘤的微血管生成的關(guān)系究竟如何?本研究首先通過檢測(cè)臨床子宮頸癌組織中的表達(dá)情況，探討EFEMP1的表達(dá)與子

4、宮頸癌血管生成以及生物學(xué)行為的關(guān)系；進(jìn)而在細(xì)胞水平上探討EFEMP1影響子宮頸癌血管生成的可能機(jī)制；最后在動(dòng)物腫瘤模型實(shí)驗(yàn)水平證實(shí)EFEMP1對(duì)子宮頸癌生長(zhǎng)的影響。
　　 第一章子宮頸癌組織中EFEMP1的表達(dá)對(duì)子宮頸癌微血管形成及生物學(xué)行為的影響
　　 目的：探討EFEMP1在子宮頸癌組織中的表達(dá)及其與宮頸癌的微血管生成和生物學(xué)行為的關(guān)系。
　　 方法：于100例臨床子宮頸癌標(biāo)本和10例宮頸炎正常上皮對(duì)照組織中

5、，采用免疫組化MaxivisionTM方法檢測(cè)EFEMP1的表達(dá)，并采用原位雜交方法檢測(cè)其中VEGF mRNA的表達(dá)。用CD34組化標(biāo)記微血管內(nèi)皮，以計(jì)數(shù)各個(gè)樣本組織中微血管密度(microvascular density，MVD)。結(jié)合各病例的臨床病理參數(shù)，分析EFEMP1蛋白的表達(dá)與宮頸癌生物學(xué)行為的關(guān)系，并對(duì)EFEMP1表達(dá)與VEGFmRNA表達(dá)和MVD之間進(jìn)行相關(guān)性分析，以初步探討EFEMP1與宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其可能機(jī)制

6、。
　　 結(jié)論：(1)EFEMP1高表達(dá)于宮頸癌組織中，并與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)有關(guān)；(2)EFEMP1可能通過上調(diào)宮頸癌VEGF的表達(dá)而促進(jìn)宮頸癌微血管的增生；(3)EFEMP1的高表達(dá)與宮頸癌的預(yù)后不良有關(guān)，可視為獨(dú)立的預(yù)后不良因素。
　　 第二章 EFEMP1對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力、VEGF表達(dá)及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成能力影響的研究
　　 目的：研究EFEMP1蛋白對(duì)子宮頸癌

7、細(xì)胞的增殖、侵襲能力、VEGF表達(dá)及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和管腔形成能力的影響
　　 方法：不同濃度人工重組EFEMP1蛋白作用宮頸癌Hela細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)EFEMP1對(duì)Hela細(xì)胞增殖能力的影響：不同濃度人工重組蛋白EFEMP1蛋白作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，同時(shí)用不同濃度的VEGF因子處理HUVECs做內(nèi)對(duì)比，用MTT法檢測(cè)兩種作用因素處理后HUVECs生長(zhǎng)增殖情況。Transwell小室法檢測(cè)EFE

8、MP1對(duì)Hela侵襲能力的影響以及對(duì)HUVECs遷移能力的影響。采用Rose Bengal活細(xì)胞染色法，檢測(cè)EFEMP1對(duì)Hela細(xì)胞與HUVECs之間黏附力的影響。通過Matrigel膠體外內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力實(shí)驗(yàn)，觀察EFEMP1對(duì)HUVECs體外管腔形成能力的影響。用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，通過轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pCMV6質(zhì)粒，將EFEMP1基因瞬時(shí)導(dǎo)入宮頸癌Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h，取細(xì)胞上清液，采用夾心酶聯(lián)免疫

9、吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞上清液中VEGF表達(dá)，以檢測(cè)EFEMP1基因轉(zhuǎn)染對(duì)Hela細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。
　　 結(jié)論：(1)EFEMP1能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和VEGF表達(dá)；(2)EFEMP1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能無直接影響；(3)EFEMP1提高宮頸癌血管生成活性可能是通過其提高宮頸癌VEGF表達(dá)水平的途徑實(shí)現(xiàn)，而不是通過直接影響內(nèi)皮細(xì)胞功能的途徑實(shí)現(xiàn)。
　　 第三章 EFEMP1基因轉(zhuǎn)染對(duì)子宮頸癌

10、生長(zhǎng)影響的研究
　　 目的：探討EFEMP1基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠實(shí)驗(yàn)性子宮頸癌的生長(zhǎng)的影響。
　　 方法：：通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，利用真核表達(dá)載體pCMV6質(zhì)粒，將EFEMP1基因?qū)雽m頸癌Hela細(xì)胞，經(jīng)抗生素G418篩選獲得抗性克隆，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PR-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞中EFEMP1基因的表達(dá)，并通過免疫蛋白印跡技術(shù)(western-blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞中EFEMP1蛋白的表達(dá)情況，

11、以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。BALB/c雌性裸鼠9只，5～7周，SPF條件飼養(yǎng)，隨機(jī)分為3組，每組3只。將轉(zhuǎn)染EFEMP1基因的Hela細(xì)胞(Hela-EFEMP1)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的陰性對(duì)照組細(xì)胞(Hela-vector)和正常Hela細(xì)胞分別接種于3組裸鼠皮下，以構(gòu)建宮頸癌裸鼠荷瘤模型。待成瘤后，隔日觀察3組腫瘤的生長(zhǎng)情況，并于接種后的第30天處死裸鼠，稱取腫瘤重量并取材。將各組取下的腫瘤組織固定、包埋、切片，利用免疫組化MaxvisionTM