EVI1高表達(dá)急性髓系白血病的臨床、細(xì)胞遺傳學(xué)特征和初步發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　1、分析2007年1月至2015年4月期間于本中心經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)分型(MIC)確診并住院接受治療的447例初診急性髓系白血病(AML)患者的EVI1表達(dá)水平，分析其臨床和細(xì)胞遺傳學(xué)等特征，對(duì)EVI1高表達(dá)患者的細(xì)胞遺傳學(xué)特征進(jìn)行深入分析。
　　2、對(duì)151例處于第一次緩解期行清髓性異基因造血干細(xì)胞移植患者的EVI1表達(dá)特征和臨床意義進(jìn)行分析，分析EVI1基因表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響。
　　3、

2、采用基因芯片等技術(shù)手段篩選與EVI1高表達(dá)相關(guān)的微小RNA(microRNA)，并初步探討11p15重排導(dǎo)致EVI1高表達(dá)的機(jī)制。
　　方法:
　　1、通過(guò)制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的方法建立EVI1絕對(duì)定量檢測(cè)的方法。利用建立的RQ-PCR方法對(duì)本中心447例初診AML患者的EVI1水平進(jìn)行檢測(cè)，并收集患者的人口學(xué)、初診血細(xì)胞計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和AML常見(jiàn)基因突變等資料;并對(duì)緩解率和緩解后的無(wú)白血病生存進(jìn)行分析。
　　2、

3、回顧性分析了151例處于第一次緩解期接受清髓性異基因造血干細(xì)胞移植的AML患者，分析其臨床特點(diǎn)、移植類(lèi)型、EVI1表達(dá)水平、細(xì)胞遺傳學(xué)特征和基因突變類(lèi)型對(duì)患者預(yù)后的影響，并進(jìn)行單因素和多因素的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、通過(guò)microRNA表達(dá)譜分析研究與EVI1相關(guān)的microRNA的水平變化并對(duì)顯著負(fù)相關(guān)的兩種microRNA進(jìn)行驗(yàn)證以及靶基因預(yù)測(cè);利用基因表達(dá)譜和RQ-PCR研究11p15重排的AML高表達(dá)EVI1的特點(diǎn)，并通過(guò)體

4、外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)初步揭示11p15重排和EVI1高表達(dá)之間的聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了EVI1定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，驗(yàn)證了RQ-PCR的工作曲線，對(duì)正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞的EVI1表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，分別為EVI1-1d:99.812±94.823/10000PBGD, MDS1EVI1:186.171±188.678/10000PBGD, cEVI1:1198.428±1266.043/10000PBGD（均值±標(biāo)準(zhǔn)差），界定了

5、EVI1高低表達(dá)的界線值為10倍正常骨髓的均值。
　　在447例初診AML中，EVI1高表達(dá)者為80例（占17.9％），EVI1低表達(dá)者為367例（占82.1％）。兩組的年齡、性別分布無(wú)明顯差異，兩組外周血血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)均未見(jiàn)到明顯差異。形態(tài)學(xué)方面，M5和M6在EVI1高表達(dá)組顯著增多（p=0.0038和0.01），M3在低表達(dá)組中有增多的趨勢(shì)(p=0.08)。
　　細(xì)胞遺傳學(xué)方面，顯著傾向于EVI1高

6、表達(dá)組分布的核型為11 q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)（p分別為＜0.0001，＜0.0001，0.0006，0.0135），尤其發(fā)現(xiàn)了5例存在重現(xiàn)性11p15重排的病例均伴有EVI1高表達(dá)(p＜0.0001)。擴(kuò)大驗(yàn)證后的12例11p15重排均發(fā)現(xiàn)EVI1高表達(dá)。而顯著傾向于在EVI1低表達(dá)組占優(yōu)勢(shì)的核型為正常核型、inv(16)、t(8;21)(p=0.001，0.009，0.002)。按照細(xì)胞遺傳

7、學(xué)危險(xiǎn)度的分組分布中，低中高危組均顯示兩組分布的顯著性差異(p＜0.0001，p=0.044，p＜0.0001)，其中低、中危組在EVI1低表達(dá)組顯著占優(yōu)勢(shì)，而高危組則在EVI1高表達(dá)組占優(yōu)勢(shì)。AML常見(jiàn)突變方面，NPM1突變更傾向于分布于EVI1低表達(dá)組(p=0.0003)。結(jié)合了細(xì)胞遺傳許和分子突變特征的NCCN2014關(guān)于AML危險(xiǎn)度的分層，高危組更傾向分布于EVI1高表達(dá)組(p＜0.0001)，而低危組傾向分布于EVI1低表達(dá)組

8、(p＜0.0001)。對(duì)于≤60歲的患者，EVI1高表達(dá)組緩解率明顯低于EVI1低表達(dá)組，兩組CR率分別為37.5％ v.s.69.4％，存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.0001)。兩組緩解后的無(wú)白血病生存也顯示類(lèi)似趨勢(shì)(p=0.031)。對(duì)于11 q23/MLL重排，高EVI1表達(dá)在M5亞型多見(jiàn)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.231)，而t(11;19)(q23;p13)和t(6;11)(q27;q23)核型在EVI1高表達(dá)組顯示出優(yōu)勢(shì)的

9、趨勢(shì)(p=0.077)。11 q23/MLL重排中，EVI1高表達(dá)組的緩解率顯示出明顯低于低表達(dá)組的趨勢(shì)(p=0.061)。-7/7q-核型中，單獨(dú)-7占EVI1高表達(dá)組的比例更高(4/7)，兩組的完全緩解率未見(jiàn)顯著性差異。應(yīng)用FISH技術(shù)，發(fā)現(xiàn)3q26重排存在多種斷裂重排方式，并發(fā)現(xiàn)5例3q27、3q29重排為隱匿性3q26重排。
　　2、151例處于第一次緩解期行清髓性異基因造血干細(xì)胞移植的患者中，EVI1高表達(dá)組和低表達(dá)組比

10、較，年齡、性別、初診時(shí)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例均無(wú)明顯差異;M5分型在高表達(dá)組更占優(yōu)勢(shì)(p=0.0015);細(xì)胞遺傳學(xué)構(gòu)成上，11 q23/MLL重排在高表達(dá)組更占優(yōu)勢(shì)(p＜0.0001)，正常核型在低表達(dá)組更占優(yōu)勢(shì)(p＜0.0001)。細(xì)胞遺傳學(xué)危險(xiǎn)度中低危組占EVI1低表達(dá)組的比例更高(p＜0.0001)。常見(jiàn)的AML突變?cè)趦山M構(gòu)成中無(wú)明顯差異。
　　EVI1高表達(dá)和低表達(dá)組接受不含照射的MAC方案的比例、接受親緣或

11、無(wú)關(guān)供體的人數(shù)比、接受骨髓干細(xì)胞外周血造血干細(xì)胞和臍帶血干細(xì)胞來(lái)源的構(gòu)成比均未見(jiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在接受骨髓和外周血造血干細(xì)胞混合輸注方面，EVI1高表達(dá)組為14例(44％)顯著高于EVI1低表達(dá)組(p=0.0039)。在HLA匹配情況方面，采用部分相合供體的EVI1高表達(dá)組患者例數(shù)為16例(50％)，顯著高于EVI1低表達(dá)組(p=0.0333)。移植后所有患者均獲得造血重建，移植后1個(gè)月均獲得完全嵌合。100天內(nèi)累積aGVHD(Ⅱ-Ⅳ

12、°)發(fā)生率為21％±5％，7例患者發(fā)生重度aGVHD(Ⅲ-Ⅳ°)。累積cGVHD發(fā)生率為30％±10％。15例患者2年內(nèi)出現(xiàn)廣泛型cGVHD。
　　患者2年總體生存率為68.5％(59.9-76.5％);無(wú)事件生存率為67.4％(58.5-74.6％)。中位隨訪時(shí)間26個(gè)月（2-60個(gè)月）。EVI1高表達(dá)組24個(gè)月OS為52.8％(32.5-69.5％)，較低表達(dá)組72.4％(63-80％)顯著降低(p=0.0122);LFS為5

13、6.7％(34.9-73.7％)，同樣較低表達(dá)組76.1％(66.6-83.2％)顯著降低(p=0.0083)。以無(wú)復(fù)發(fā)死亡作為競(jìng)爭(zhēng)性因素，EVI1高表達(dá)組24個(gè)月時(shí)的累積復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)組，分別為39.5％(20.9-57.6％)和22.5％(15.2-30.7％)(p=0.013)。針對(duì)LFS進(jìn)行的單因素分析結(jié)果表明，EVI1低表達(dá)和中危的細(xì)胞遺傳學(xué)分組是有利于LFS的預(yù)后因素(p＜0.05)，而針對(duì)OS進(jìn)行的單因素分析表明，更

14、低的年齡、EVI1低表達(dá)、ITD野生型、中低危的細(xì)胞遺傳學(xué)、NPM1野生型均為有利于OS的預(yù)后因素(p均＜0.05)。多因素分析結(jié)果表明，EVI1表達(dá)為L(zhǎng)FS唯一的獨(dú)立預(yù)后因素，低表達(dá)有利于預(yù)后（HR=0.44，95％CI0.23-0.84，p=0.014）。ITD突變和低危、中危的遺傳學(xué)分型為OS的獨(dú)立預(yù)后因素。野生型ITD有利于預(yù)后(HR=0.31，95％CI0.15-0.63，p=0.001);低危核型利于預(yù)后(HR=0.11，9

15、5％CI0.01-0.86，p=0.03)，中危核型同樣有利于OS(HR=0.43，95％CI0.24-0.78，p=0.005)。以NCCN2014關(guān)于AML危險(xiǎn)度分層取代細(xì)胞遺傳學(xué)分組和常見(jiàn)AML突變的單因素分析表明，EVI表達(dá)高低以及中危的NCCN分組對(duì)LFS的預(yù)后有顯著性影響，而多因素分析表明，僅有NCCN中危險(xiǎn)度組為有利于OS的唯一有利因素(HR=0.37，95％CI0.21-0.64，p=0.0004)?；诩?xì)胞遺傳學(xué)分層對(duì)

16、EVI1的分層分析表明，EVI1表達(dá)狀態(tài)對(duì)LFS和OS均未產(chǎn)生明顯影響。
　　3、結(jié)合107例初診AML的microRNA表達(dá)譜分析以及EVI1定量分析，篩選出與EVI1表達(dá)負(fù)相關(guān)的microRNA為miR-181a(Fold change0.368，p=0.00018)、miR-128b(Fold change0.465, p=0.002)、miR-181c(Fold change0.470, p=0.001)、miR-128a

17、(Fold change0.479，p=0.002)，正相關(guān)的為miR-151-3p、mir-500、miR-143、miR-199a-5p、miR-363、miR-148a、miR-151-5p、miR-125a-5p、miR-99b。利用RT-PCR方法對(duì)驗(yàn)證了71例初診AML的miR-128a的相對(duì)表達(dá)在EVI1高表達(dá)和低表達(dá)組中存在顯著性差異(p=0.0015)，miR-181a的相對(duì)表達(dá)存在顯著性差異(p=0.05)。利用Ta

18、rgetscan預(yù)測(cè)miR-128a的可能調(diào)節(jié)靶基因?yàn)镠OXA9等HOX家族成員，miR-181a的可能調(diào)節(jié)靶基因?yàn)锽cl-2。
　　10例11p15重排的AML基因表達(dá)譜表明EVI1d型是NUP98重排白血病患者表達(dá)上調(diào)的主要形式，而ME(MDS1EVI1)剪接型表達(dá)則處于低水平。HOX家族中，HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXAB處于較高表達(dá)水平。RQ-PCR驗(yàn)證證實(shí)8例t(7;1

19、1)((p15;p15)的EVI1表達(dá)中，cEVI1、EVI-1d升高，而MDS1/EVI1表達(dá)無(wú)明顯升高。
　　利用NUP98/HOXA9、NUP98/HOXD8對(duì)K562細(xì)胞和293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染表明，NUP98/HOXA9對(duì)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染后cEVI1的相對(duì)表達(dá)有所上升。
　　通過(guò)構(gòu)建的連接NUP98/HOXA9不同結(jié)構(gòu)片段和EVI1啟動(dòng)子區(qū)的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)GLFG段對(duì)EVI1啟動(dòng)子活性有顯著影響。
　　結(jié)

20、論:
　　1、EVI1高表達(dá)在AML中發(fā)生率為17.9％，在M5中較為多見(jiàn)，常見(jiàn)的細(xì)胞遺傳學(xué)異常包括11q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)和11p15重排。高表達(dá)組緩解率明顯降低，這一趨勢(shì)同樣表現(xiàn)在單獨(dú)進(jìn)行的11q23/MLL重排患者中。
　　2、處于第一次完全緩解期接受清髓性異基因造血干細(xì)胞移植的AML患者，初診時(shí)EVI1高表達(dá)患者的無(wú)白血病生存率、總體生存率、累積復(fù)發(fā)率明顯差于低表達(dá)患者，E