黑素瘤三維培養(yǎng)模型的建立及肉桂醛抑制黑素瘤細(xì)胞增殖和侵襲的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性黑素瘤(malignantmelanoma，MM)是一種高度惡性的腫瘤，是皮膚腫瘤中侵襲性和致死性最強(qiáng)的一種，嚴(yán)重威脅人類生命健康。惡性黑素瘤無限增殖和侵襲性生長(zhǎng)是決定其臨床預(yù)后的關(guān)鍵因素。因此研究惡性黑素瘤細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)，尋找有效抑制其增殖和侵襲的方法，是惡性黑素瘤防治研究的重要切入點(diǎn)。
　　二維培養(yǎng)是研究黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的主要手段，能直觀和便利地反映黑素瘤細(xì)胞的一部分生物學(xué)特性，但因缺少細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)間的相

2、互作用和信息交流，黑素瘤細(xì)胞的部分特性與在體時(shí)比較存在差異，不能全面反映黑素瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。而三維培養(yǎng)提供的空間結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)環(huán)境可模擬體內(nèi)的情況，能更真實(shí)地反映細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)室已在體外成功構(gòu)建了復(fù)方殼多糖組織工程皮膚，在此基礎(chǔ)上建立黑素瘤的體外三維培養(yǎng)模型，對(duì)于研究惡性黑素瘤的生物學(xué)特性以及進(jìn)行藥物療效評(píng)價(jià)更具優(yōu)勢(shì)。目前多種不同的黑素瘤細(xì)胞株已被分離培養(yǎng)，并用于黑素瘤的生物學(xué)特性研究，本研究使用的A375

3、細(xì)胞具有較強(qiáng)侵襲能力，是皮膚黑素瘤細(xì)胞株中具有代表性的一種。
　　肉桂醛是一種醛類有機(jī)化合物，除了作為食品添加劑外，也具有抗真菌、抗病毒和抗腫瘤等醫(yī)藥效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)首先在二維培養(yǎng)條件下觀察了肉桂醛對(duì)人皮膚黑素瘤A375細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響，然后在實(shí)驗(yàn)室原有組織工程皮膚的基礎(chǔ)上加入A375細(xì)胞，建立黑素瘤三維培養(yǎng)模型，進(jìn)一步檢測(cè)了肉桂醛在三維培養(yǎng)條件下對(duì)A375細(xì)胞增殖和侵襲的影響。本研究方法、結(jié)果和結(jié)論分述如下:
　　方

4、法:
　　1、A375細(xì)胞體外擴(kuò)增，貼壁生長(zhǎng)近融合后，在培養(yǎng)基中分別加入0（對(duì)照組）、10、20和40μM肉桂醛溶液，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，ELISA、westernblot法檢測(cè)VEGF表達(dá)水平，明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9分泌水平，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況。
　　2、將A375細(xì)胞加至復(fù)方殼多糖膠原凝膠的支架內(nèi)行三維培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中分別加入0（對(duì)照組）

5、、10、20和40μM肉桂醛溶液，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，ELISA、westernblot法檢測(cè)VEGF表達(dá)水平，明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9分泌水平。
　　3、分別在組織工程皮膚基質(zhì)表面和基質(zhì)中接種A375細(xì)胞，進(jìn)行氣-液面交界培養(yǎng)或浸沒培養(yǎng)，HE染色觀察A375細(xì)胞生長(zhǎng)情況，選擇最合適的接種方式和培養(yǎng)方法，以便構(gòu)建符合體內(nèi)實(shí)際情況的黑素瘤三維培養(yǎng)模型。
　　4、采用二步酶分離方法分離培養(yǎng)KC、FB，并連續(xù)傳代。在組織工程

6、皮膚基礎(chǔ)上加入A375細(xì)胞，在培養(yǎng)第5、10和15天固定組織工程皮膚標(biāo)本，HE染色觀察A375細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲情況，透射電鏡觀察A375細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，免疫組織化學(xué)觀察E-Cadherin、PCNA、MMP-9表達(dá)情況。
　　5、皮膚惡性黑素瘤三維培養(yǎng)的第5天開始在培養(yǎng)基內(nèi)分別加入肉桂醛溶液，培養(yǎng)第10、15天固定組織工程皮膚標(biāo)本，HE染色觀察A375細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲情況，免疫組織化學(xué)觀察PCNA、MMP-9表達(dá)情況。
　　6、二

7、維和三維培養(yǎng)的A375細(xì)胞經(jīng)肉桂醛處理后，基因芯片檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，ELISA法檢測(cè)NF-κB活化情況。
　　結(jié)果:
　　1、肉桂醛能促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞增殖指數(shù)。10μM肉桂醛作用24小時(shí)即能抑制A375細(xì)胞增殖，10、20、40μM肉桂醛間的抑制強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。40μM的肉桂醛作用72小時(shí)后細(xì)胞增殖抑制率最高，達(dá)88.91±4.5％。與對(duì)照組(0μM)相比，40μM肉桂醛作用后A37

8、5細(xì)胞增殖指數(shù)最低（53.38±4.25％vs35.13±3.24％），細(xì)胞凋亡百分比最高（4.37±0.25％vs10.50±0.37％）。各濃度間作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肉桂醛能抑制三維支架內(nèi)A375細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，10、20、40μM肉桂醛間的抑制強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并呈劑量依賴性(P＜0.01)。
　　2、肉桂醛能抑制A375細(xì)胞的遷移，也能抑制A375細(xì)胞的侵襲，抑制強(qiáng)度和肉桂醛濃度成正比，各濃度間

9、作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、肉桂醛作用后二維和三維支架內(nèi)A375細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)下降(2D:1.193±0.195vs0.204±0.017;3D:1.549±0.214vs0.392±0.019)，各濃度間的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。MMP-9的分泌也減少（2D:24885.83±865.80vs14150.77±555.63;3D:29408.50±817.62vs15121.43±4

10、97.95）。各濃度肉桂醛間的抑制強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、在組織工程皮膚表面接種A375細(xì)胞行氣-液面交界培養(yǎng)是最合適的黑素瘤三維培養(yǎng)方式和方法。在培養(yǎng)第5天即觀察到A375細(xì)胞向真皮侵襲，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，A375細(xì)胞侵襲深度越深，第15天皮膚分化良好，大量A375細(xì)胞團(tuán)塊向真皮深部侵襲。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞核異形，細(xì)胞器豐富。腫瘤細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)缺失，MMP-9和PCNA表達(dá)強(qiáng)度隨侵襲深度

11、增加而增強(qiáng)，在培養(yǎng)第5天、10天和15天間的表達(dá)強(qiáng)度均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。PCNA的陽性率在培養(yǎng)第5天、10天和15天間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　5、肉桂醛能抑制三維培養(yǎng)模型內(nèi)惡性黑素瘤A375細(xì)胞的增生和侵襲。肉桂醛作用后A375細(xì)胞數(shù)目減少，侵襲深度變淺，微弱表達(dá)PCNA和MMP-9。肉桂醛處理前后PCNA和MMP-9的表達(dá)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　6、肉桂醛能抑制二維和三維培養(yǎng)的