雞貧血病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位研究及感染性克隆構(gòu)建.pdf

1、為了研究雞貧血病毒(Chicken anemiavirus,CAV)VPI蛋白的抗原表位,本研究根據(jù)生物軟件Lasergene對(duì)VPl蛋白抗原性的分析結(jié)果,將VPI蛋白進(jìn)行了分段表達(dá),選取缺失VPI N端68個(gè)氨基酸的融合表達(dá)產(chǎn)物VPI-A進(jìn)行純化,免疫BALB/c鼠,制備了6株抗VPl蛋白的單克隆抗體(MAb).以這些MAbs對(duì)分段表達(dá)的VPI蛋白進(jìn)行Western blot分析,在VPl蛋白上初步鑒定出3個(gè)抗原位點(diǎn),分別位于:VPI

2、的219-274氨基酸(aa)殘基、324-369aa和275-302aa殘基內(nèi). 為了更詳細(xì)而全面地了解VPl蛋白的抗原結(jié)構(gòu),構(gòu)建了vpl基因特異性噬菌體展示肽庫(kù),利用多克隆抗體對(duì)肽庫(kù)進(jìn)行3輪淘選,得到9個(gè)陽(yáng)性噬菌體.序列分析表明,有5個(gè)克隆展示有相同的序列"T<'309>YMSFATLTALGAQWSFPPGQRSVSRRSFNHHKARG<'344>",有4個(gè)克隆展示有相同的序列"M<'169>.FGGWHLFRHIETR

3、FQLLA<'214>".利用制備的6株MAbs與這些陽(yáng)性噬菌體進(jìn)行Westernblot分析,結(jié)果表明2F3等4株MAbs與噬菌體P12反應(yīng).為了對(duì)這4株MAbs及MAb 4D5對(duì)應(yīng)的表位精確定位,人工合成一系列成對(duì)的寡核苷酸,退火后插入pET32a載體中進(jìn)行融合表達(dá).利用MAbs對(duì)融合蛋白進(jìn)行Western blot反應(yīng)性掃描,鑒定出2F3等4株MAbs對(duì)應(yīng)的表位位于D<'245>HQNRWRKG<'245>.利用同樣的方法鑒定出M

4、Ab 4D5對(duì)應(yīng)的表位位于W<'353>HTLVPLGTE<'362>. 根據(jù)生物軟件Lasergene對(duì)VP2蛋白的分析發(fā)現(xiàn)該蛋白具有良好的抗原性,為了對(duì)其進(jìn)行表位作圖(epitope mapping),首先在E.coli中克隆、表達(dá)了VP2蛋白全長(zhǎng),純化后免疫BALB/c鼠,制備了7株抗VP2蛋白的單克隆抗體.人工合成一套彼此重疊6個(gè)氨基酸長(zhǎng)度為16個(gè)氨基酸并覆蓋VP2全長(zhǎng)的短肽,融合表達(dá)后與MAbs進(jìn)行Westem blo

5、t和ELISA反應(yīng)性掃描,鑒定出3個(gè)抗原表位, 分別為G<'21>QPGPSGAAQGQVISN<'36>,Ll<'111>EDRSTQASLEEAILR<'126>和E<'121>EAILRPLRVQGKRAK<'136>,而G<'16>'AAQ<'20>,Q<'117>ASL<'120>和p<'127>LRV<'130>.分別為各表位的的主要功能區(qū).用這3個(gè)純化后的融合短肽免疫BALB/c鼠,結(jié)果表明這些融合蛋白均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生VP

6、2蛋白的特異性抗體. 為了研究vp3基因?qū)Σ《緩?fù)制及致病力的影響,構(gòu)建了CAV的感染性克隆及vp3完全缺失(pBluem2CAVVP3')和NLS2缺失(pBluem2CAVNLS2')的兩個(gè)突變體.首先構(gòu)建了含有CAV雙拷貝基因組順向串聯(lián)的重組子,轉(zhuǎn)染MDCC-MSBI細(xì)胞,獲得了能夠自我復(fù)制的CAV,體內(nèi)試驗(yàn)顯示該質(zhì)粒注入雞體內(nèi),可以引起與CAV感染相似的病理變化.又對(duì)vp3基因及vp3基因C端的核定位信號(hào)(Nuclear

7、location signal NLS)進(jìn)行缺失,分別構(gòu)建了帶有缺失的突變體pBluem2CAVVP3<'->和pBIuem2CAVNLS2<'->,轉(zhuǎn)染MDCC-MSBI細(xì)胞,初步證實(shí)vp3基岡缺失后在體內(nèi)體外均檢測(cè)不到病毒復(fù)制,但vp3 C端NLS2缺失后在體外可以檢測(cè)到病毒復(fù)制,而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示NLS2缺火的突變體可以引起雞胸腺小體數(shù)目增多等變化.CAV感染性克隆的構(gòu)建為獲得純化的病毒及研制新型疫苗奠定了基礎(chǔ),兩個(gè)vp3基因突變