周期素依賴性蛋白激酶亞單位1(Cks1)在人腦膠質瘤中的表達及意義.pdf

1、研究目的:
　　 人腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，目前的治療仍以傳統(tǒng)的手術切除聯(lián)合放療和化療，由于腫瘤的高度增殖及惡性侵襲而無法徹底治愈?；蛑委熓墙鼇硇屡d的膠質瘤治療手段，通過研究膠質瘤的特異性蛋白及基因，運用靶向方法，來達到抑制腫瘤生長甚至消除腫瘤的目的，但該治療目前尚處于探索階段。尋找能調控膠質瘤細胞惡性生物學行為的分子靶點并探索其在膠質瘤發(fā)病過程中的可能作用機制，已成為神經(jīng)科學領域的研究熱點之一。本研究通過

2、檢測周期素依賴性蛋白激酶亞單位1（cyclin kinase subunit1，Cks1）在人腦膠質瘤及正常腦組織中的表達差異，并結合患者臨床病理學及隨訪資料進行統(tǒng)計學分析，初步探討Cks1表達與膠質瘤病理級別、生存預后的關系;進一步通過過表達Cks1慢病毒載體構建，檢測Cks1過表達對膠質瘤細胞系的細胞周期的影響，從而探討Cks1在膠質瘤發(fā)生發(fā)展生物學過程中的可能作用，或為膠質瘤臨床治療提供新的分子靶標。
　　 研究方法:

3、r>　　 運用免疫組織化學EnVision法及蛋白印跡實驗檢測Cks1，Skp2，p27在腦膠質瘤組織切片及正常腦組織切片中的蛋白表達水平，對樣本患者進行臨床病例資料的隨訪，結合患者病理學特征運用統(tǒng)計學軟件進行相關統(tǒng)計學分析。運用PCR等技術構建Cks1過表達慢病毒載體LV5(EF1-GFP/Puro)，蛋白印跡實驗檢測Cks1的表達量并通過流式細胞學技術分析Cks1過表達后膠質瘤細胞系A172細胞周期的影響，初步探討Cks1在腦膠質

4、瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能角色。
　　 結果:
　　 免疫組織化學EnVision法顯示Cks1蛋白主要表達在腫瘤細胞細胞核。在正常腦組織中幾乎全部有表達，其陽性染色的細胞百分率為58.54±15.66％，在低級別膠質瘤（WHOⅠ～Ⅱ級）和高級別膠質瘤（WHOⅢ～Ⅳ級）中的陽性染色的細胞百分率分別為31.25±27.50％和19.62±18.75％，隨著病理級別增高而有降低趨勢，三者比較有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。Skp2

5、、p27蛋白主要表達在腫瘤細胞細胞核。在正常腦組織中Skp2全部無表達，低級別膠質瘤（WHOⅠ～Ⅱ級）和高級別膠質瘤(WHOⅢ～Ⅳ級)中陽性染色的細胞百分率分別為6.97±5.50％和17.51±17.68％，隨著病理級別增高而有增高趨勢，三者比較有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。在正常腦組織中p27表達強陽性，正常腦組織、低級別膠質瘤(WHOⅠ～Ⅱ級)和高級別膠質瘤(WHOⅢ～Ⅳ級)中陽性染色的細胞百分率分別為85.50±7.17％、51

6、.11±19.87％和23.78±17.53％，隨著病理級別增高而有下降趨勢，三者比較有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。蛋白印跡實驗顯示Cks1在正常腦組織，低級別膠質瘤和高級別膠質瘤中的蛋白印跡實驗條帶光密度相對值分別為6.43±1.03、3.61±1.45、1.21±0.87，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。在三個蛋白兩兩比較中，統(tǒng)計分析提示僅Cks1與p27表達之間呈正相關(r=0.38，p＜0.05)，Cks1和Skp2表

7、達之間無相關性(r=0.08，p＞0.05)，p27和Skp2之間無相關性(r=-0.16，p＞0.05)。在評價膠質瘤預后的影響因素時，Cox回歸單因素分析提示低腫瘤級別、全切除率、低Skp2和高p27表達對生存預后有利(p＜0.05)，Cks1表達水平對膠質瘤患者生存時間無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。進一步在高級別膠質瘤亞組中對臨床有意義指標年齡、切除率、Cks1和Skp2表達水平運用Cox比例風險模型多因素分析，結果提示年齡＜55

8、歲、全切除及Cks1高表達的膠質瘤患者有更好的預后(p＜0.05)。通過PCR等技術成功構建過表達Cks1慢病毒載體LV5(EF1-GFP/Puro)，轉染膠質瘤細胞系A172后蛋白印跡實驗提示Cks1表達量較母細胞系增高(5.77±0.92 vs2.46±0.12，p＜0.05)。經(jīng)流式細胞學技術分析提示過表達Cks1后腫瘤細胞時相變化主要集中在G2/M期，與無目的基因Cks1的干擾組細胞系比較，有統(tǒng)計學意義（38.13±0.72 v