富氫生理鹽水對大鼠顱腦損傷的保護機制研究.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)傷性腦損傷(Traumaticbraininjury，TBI)是由直接和間接外力引起的大腦嚴重受損的疾病，疾病多發(fā)于年輕患者，絕大部分的幸存者有不同程度的身體、心理和神經(jīng)功能障礙，具有高發(fā)病率、致殘率和高死亡率等特性，會使家庭和社會精神及經(jīng)濟負擔過重。但是現(xiàn)在，治療創(chuàng)傷性腦損傷是有限的，因此進一步研究創(chuàng)傷性腦損傷后的生理和病理變化的機制，尋找新的有效的治療靶點一直在創(chuàng)傷性腦損傷的研究熱點和難點。導致進一步的腦損傷

2、創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損傷（Secondarybraininjury，SBI）的主要病理機制，二次腦損傷發(fā)生在受傷的幾分鐘后幾天或更長時間，這是逐步發(fā)展的基礎上，主要的損傷病理變化，是創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元損傷，甚至死亡的重要原因，因此二次腦損傷的治療是改善腦外傷患者的預后的關鍵。最近的研究表明，氧自由基造成的創(chuàng)傷性腦損傷后，特別是超氧陰離子的連鎖反應是受損的神經(jīng)元病理環(huán)節(jié)的核心。主要損傷的基礎上，因為血管組織局部缺血，缺氧，缺血再灌注和

3、出血等，可以產(chǎn)生大量的有毒的氧自由基，如脂質(zhì)過氧化(LPO)，過氧化氫和O2-，OH-，等。由于自由基的性質(zhì)活潑，自由基氧化應激和級聯(lián)，不斷形成新的自由基或活性氧代謝產(chǎn)物。會導致蛋白質(zhì)氧化，脂質(zhì)氧化，細胞核溶解，呼吸鏈中斷，細胞凋亡等。因此，尋找選擇性和氧自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用的藥物是正確治療自由基損傷的主要方法。當前，氫氣抗氧化作用的研究日益成為國內(nèi)外學者關注的焦點，氫氣是一種無色、無嗅、無味的雙原子氣體。近年來文獻報道，氫并不是

4、生理惰性氣體，而是理想的抗氧化劑，選擇性抗氧化作用可以中和有害的自由基，保護細胞DNA，蛋白質(zhì)等，不破壞線粒體并保持正常功能，防止細胞凋亡。為進一步探討氫氣在腦損傷中的治療作用，本研究采用自制富氫生理鹽水干預大鼠顱腦損傷模型，腦損傷后連續(xù)7d進行腹腔注射，通過行為學，組織病理學及分子生物學等多方面探討富氫生理鹽水對腦損傷的保護作用機制，為進一步研究富氫生理鹽水在腦損傷中神經(jīng)保護作用尋找理論依據(jù)。
　　第一部分富氫生理鹽水對大鼠創(chuàng)傷

5、性腦損傷行為學的影響
　　目的：
　　觀察富氫生理鹽水對大鼠（sham組）模型運動功能及學習記憶的影響
　　方法：
　　采用改良Feeney法，建立大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，隨機分組，每組8例，分為3組，分別為：假手術組（sham組）、腦損傷組（TBI組）、腦損傷富氫生理鹽水治療組（HS組）。sham組術后一般飲食；TBI組每只大鼠10ml/kg/d給予生理鹽水腹腔內(nèi)注射；HS組每只大鼠10ml/kg/d給予富氫生理

6、鹽水腹腔內(nèi)注射，TBI組和HS組連續(xù)注射7d，術后分六次（1、3、7、14、21、28d）mNSS神經(jīng)功能評分對神經(jīng)功能損傷進行行為學評定、平衡木平衡實驗及行走實驗來檢測3組大鼠的平衡及運動協(xié)調(diào)能力，并在術后10-14d，24-28d采用水迷宮檢驗大鼠學習記憶能力。
　　結果：
　　從一般行為學觀察發(fā)現(xiàn)TBI組及HS組大鼠，在腦損傷早期，大鼠模型進食量，飲水量均減少，后期恢復與sham組相同，重復測量檢驗結果顯示差異無統(tǒng)計學

7、意義（F[foodintake]=3.256，F(xiàn)[waterintake]=10.256，P＞0.05）；TBI組大鼠在術后體重最低，HS組大鼠體重其次，sham組大鼠體重變化不大，體重方差分析顯示差異有統(tǒng)計學意義(F=12.680，P＜0.05)。mNSS評分顯示28dsham組評分為1.80±0.45、TBI組評分為8.96±1.25、HS組評分為4.56±2.00，秩和檢驗結果發(fā)現(xiàn)差別有統(tǒng)計學意義（χ2=24.65，P＜0.05）

8、。重復測量方差分析發(fā)現(xiàn)TBI組大鼠平衡木平衡時間短于sham組及HS組(F=23.86，P＜0.05)，但是富氫組（HS組）與生理鹽水組（TBI組）之間差別無統(tǒng)計學意義(F=3.42，P＞0.05)；TBI組大鼠平衡木行走時間長于sham組及HS組(F=10.55，P＜0.05)，HS組行走時間也長于sham組(F=5.72，P＜0.05)。水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)隨著訓練時間不斷增加，在兩個不同階段發(fā)現(xiàn)三組大鼠的潛伏期卻在逐漸縮短，但與sham

9、組（sham組）及HS組（HS組）相比，TBI組（TBI組）時間延長（F=9.80，P＜0.05），sham組與HS相比差異無統(tǒng)計學意義（F=2.27，P＞0.05）。在14d時sham組目標象限所占時間為42.3±4.55％，TBI組為35.6±8.34%，HS組為36.7±7.65%，統(tǒng)計學分析顯示差異無統(tǒng)計學意義（F=2.27，P＞0.05）；28d探索試驗中 sham組目標象限所占時間為65.6±6.80%，TBI組為45.7±

10、5.27%，HS組(HS組)為56.1±7.00%，統(tǒng)計學分析差別有統(tǒng)計學意義（F=13.57，P＜0.05）；TBI組（TBI組）大鼠能夠穿過平臺次數(shù)3組中最少，與其他兩組sham組（sham組）及HS組（HS組）對比，差異無統(tǒng)計學意義（F=7.05，P＞0.05）。
　　結論：
　　經(jīng)過富氫生理鹽水治療，可以有效促進創(chuàng)傷性腦損傷大鼠體重恢復，通過修復大鼠神經(jīng)功能障礙，改善運動功能及學習記憶能力。
　　第二部分富氫生

11、理鹽水對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷病理學的治療作用
　　目的：
　　觀察富氫生理鹽水對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷范圍，腦水腫和血腦屏障功能障礙等病理改變，對神經(jīng)元存活的影響。
　　方法：
　　動物模型的建立，動物分組及干預治療措施同第一部分，按實驗方案，分批處死，術后3h，12h，24h，3d、7d標本分別采用干濕重法測量腦水腫含量，EB含量測定觀察損傷側大腦血腦屏障通透性的改變。術后3d、7d、14d標本進行HE染色觀察組織損傷病

12、理改變，術后28d標本尼氏染色觀察海馬齒狀回神經(jīng)細胞生存情況，同時觀察腦損傷范圍的改變。
　　結果：
　　HE染色發(fā)現(xiàn)TBI組損傷早期大量神經(jīng)元壞死，水腫，炎細胞浸潤，晚期見膠質(zhì)細胞增生；HS組損傷早期神經(jīng)元死亡、丟失減少，細胞水腫不明顯，后期膠質(zhì)細胞增生減少。尼氏染色計算損傷面積發(fā)現(xiàn) TBI組為31.2±4.35mm3，HS組損傷面積為18.90±3.58mm3（t=12.03，P＜0.05）。計算損傷區(qū)周圍及海馬DG區(qū)神

13、經(jīng)元細胞存活顯示 TBI組損傷區(qū)域周圍及 DG區(qū)神經(jīng)元明顯少于 HS組(F=21.35，P＜0.05)。稱重發(fā)現(xiàn)TBI組及HS組腦細胞含水量與術后3h開始逐漸增高，大約24h左右可以達到高峰，在術后3d、7d再次進行稱重實驗發(fā)現(xiàn)HS組含水量明顯低于TBI組，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.82，P＜0.05）。EB含量測定可以反映血腦屏障通透性的變化，本實驗發(fā)現(xiàn)術后24h檢測 EB的含量 TBI組和HS組高于sham組約9倍左右（F=14.

14、66，P＜0.05），3d后HS組EB含量低于TBI組，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.81，P＜0.05）。
　　結論：
　　富氫生理鹽水可以降低腦水腫及血腦屏障通透性改變，延緩病理性損傷改變，來促進減少損傷面積及保護神經(jīng)元存活，來發(fā)揮治療。
　　第一部分富氫生理鹽水在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷的腦保護分子作用機制研究
　　目的：
　　觀察富氫鹽水影響下列炎癥因子 IL-6、IL–1、TNF-a-表達式，分析丙二醛(M

15、DA)含量的本身變化，超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)動態(tài)變化檢測、和神經(jīng)細胞凋亡和細胞凋亡蛋白的表達變化。
　　方法：
　　采用目前通行改良 Feeney法建立顱腦損傷大鼠模型，大鼠隨機分為 Sham組、TBI組、HS組，HS組給予每只大鼠富氫生理鹽水10ml/kg/d腹腔注射，連用7d。隨機抽取每組大鼠5只，術后3h、12h、24h、3d、7d采用ELISA法測定炎癥因子IL-1、IL-6

16、、TNF-a的表達差異；取腦組織，制成均漿根據(jù)試劑盒，測定超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)動態(tài)變化數(shù)據(jù)和丙二醛(MDA)含量的變化。術后改變7dTUNEL法觀察細胞凋亡和GFAP蛋白的表達，免疫印跡檢測、半胱天冬酶3、Bcl-2、Bax蛋白表達。
　　結果：
　　通過ELISA檢測下列炎癥因子IL-1及，IL-6，發(fā)現(xiàn)在TBI組（生理鹽水組）及HS組（富氫組）術后3h開始其含量逐漸升高，24h

17、能夠達到高峰，兩組表達趨勢基本相同，分析其差異無統(tǒng)計學意義（F[IL-1]=1.88，P＞0.05;F[IL-6]=2.44，P＞0.05），但是表達量明顯高于sham組(F[IL-1]=41.07，P＜0.05;F[IL-6]=22.65，P＜0.05)，在3，7d，HS組表達明顯低于 TBI組，差別具有統(tǒng)計學意義（F[IL-1]=25.15，P＜0.05;F[IL-6]=14.30，P＜0.05）;而在TBI組及HS組腫瘤因子（TN

18、F-a）表達持續(xù)升高，3d后下降，兩組比較差異無顯著性(F=2.04，P＞0.05)，但是高于sham組(F=15.39，P＜0.05)。檢測3組模型發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶（SOD）含量變化數(shù)據(jù)sham組顯示最低(F=311.5，P＜0.05)，而HS組明顯高于TBI組，對比發(fā)現(xiàn)差別有統(tǒng)計學意義(F=124.2，P＜0.05)；丙二醛（MDA）含量變化數(shù)據(jù)sham組最高(F=8.103，P＜0.05)，但是，HS組卻明顯低于TBI組，差異有

19、統(tǒng)計學意義(F=165.5，P＜0.05)；而GSH-px表達在sham組最高(F=11.61，P＜0.05)，但是，HS組卻高于TBI組明顯，顯示其差別有統(tǒng)計學意義（(F=6.008，P＜0.05)）。生理鹽水組（TBI）組術后7d細胞開始出現(xiàn)明顯凋亡，并且，發(fā)現(xiàn) GFAP表達多于HS組(P＜0.05)，同時caspase-3和Bax蛋白表達多于富氫生理鹽水組注射(HS)組((P＜0.05))，Bcl-2蛋白低于HS組(P＜0.05)