聚乳酸及其共聚物生物材料的制備與生物相容性研究.pdf

1、本研究首先通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備了PLLA、PLGA、明膠纖維并使用多肽RGD對(duì)PLLA進(jìn)行改性接枝制得可提高纖維細(xì)胞親和性和細(xì)胞識(shí)別性能的乙交酯、丙交酯嗎啉-2，5-二酮聚合物(PLGAM-RGD)納米纖維薄膜；將天然高分子材料明膠、殼聚糖分別與PLLA共混紡絲，制得了兼具高分子材料與天然活性大分子優(yōu)點(diǎn)的具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)功能的納米級(jí)纖維薄膜，并利用掃描電鏡(SEM)表征了納米纖維的微觀形貌、纖維直徑等。研究進(jìn)一步從生物學(xué)的角度探討了薄膜

2、的細(xì)胞相容性，直觀的觀察了細(xì)胞在纖維薄膜上的活體狀態(tài)。通過(guò)這部分的研究，為靜電紡絲工藝制備理想的皮膚組織工程材料的選擇提供理論依據(jù)。 研究的另一部分針對(duì)聚乳酸的高疏水性、缺乏可供鍵和官能團(tuán)的活性基團(tuán)致使其生物相容性和細(xì)胞相容性不佳、在組織工程和藥物緩釋等領(lǐng)域的應(yīng)用受限的缺點(diǎn)，探索采用新型改性物質(zhì)——聚乙烯亞胺(PEI)對(duì)聚乳酸材料和微球表面進(jìn)行改性，通過(guò)溶劑揮發(fā)法制備了一系列以聚乳酸為載體的納米載藥微球，進(jìn)一步探索了借助葉酸的靶

3、向作用和異硫氰酸靶向的熒光特性制備的功能化微球，表征了多種微球的粒徑、SEM等常規(guī)性能，定性定量考察了合成后的產(chǎn)物，同時(shí)還通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考查微球材料改性后對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用和靶向性以及載藥微球?qū)?xì)胞的時(shí)間、濃度和殺傷效應(yīng)。通過(guò)PEI對(duì)聚乳酸生物材料進(jìn)行改性，對(duì)聚乳酸膜材料和載藥微球進(jìn)行表面改性和本體改性以及進(jìn)一步功能化，分析不同條件下的聚乳酸類生物醫(yī)用材料對(duì)細(xì)胞的諸多影響，為聚乳酸在藥物緩釋方面的應(yīng)用提供了一種新的設(shè)計(jì)思路。同時(shí)葉酸和異

4、硫氰酸的加入，也為更直觀的觀察驗(yàn)證細(xì)胞對(duì)靶向微球的攝取并導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡提供了一種嶄新的思路?？梢灶A(yù)見這種兩親性葉酸受體的修飾靶向給藥PLA/PEI載體微球的靶向應(yīng)用的范圍很廣。 (1)通過(guò)靜電紡絲技術(shù)可以制備得到PLLA、PLGA、PLGAM-RGD、明膠、明膠/PLLA、殼聚糖/PLLA納米纖維，并可以通過(guò)控制靜電紡絲工藝條件、聚合物體系、溶劑體系來(lái)控制其纖維的微觀形貌、纖維直徑及其分布。紡絲溶液濃度增大時(shí)，纖維形貌逐漸由蛛絲

5、狀變?yōu)榫坏睦w維狀，同時(shí)纖維的直徑隨著濃度的增加而增大；在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，紡絲電壓和接收距離對(duì)纖維的形貌影響不大。通過(guò)具有良好相容性的生物大分子明膠、殼聚糖的共混加入，改變了PLLA纖維的微觀形貌；得到的共混生物大分子/聚乳酸纖維呈扁平帶狀形貌；而制備的接有具細(xì)胞識(shí)別功能RGD的新材料PLGAM-RGD用靜電紡絲制備得到了PLGAM-RGD纖維的微觀形貌與聚乳酸纖維的微觀形貌相似。 (2)研究了各種采用靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維薄膜

6、的吸水性、保水性和水蒸氣通透性等性能發(fā)現(xiàn)，由于纖維薄膜材料的微觀結(jié)構(gòu)特征，使得靜電紡絲技術(shù)制備的纖維薄膜具有保持傷口創(chuàng)面的濕潤(rùn)、去除多余的滲液、允許氣體交換、隔熱、隔離細(xì)菌等性能。 (3)以靜電紡絲制備以PLLA、PLGA、PLGAM-RGD、明膠/PLLA、殼聚糖/PLLA等納米纖維薄膜支架具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。PLGAM-RGD、明膠/PILA、殼聚糖/PLLA制備的靜電紡絲纖維薄膜表面細(xì)胞生長(zhǎng)情況比在其他材料制備的纖維材料上更密

7、集、良好，說(shuō)明三種支架更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼附，細(xì)胞親和性和生物相容性最佳。 (4)研究通過(guò)溶液澆鑄法制備了聚乳酸平面膜材料模型，并通過(guò)在膜表面鍵合PEI分子、繼而在溶液中借助戊二醛的固定作用在聚乳酸平面膜上自組裝單層殼聚糖分子從而構(gòu)筑具有高細(xì)胞親和性的PEI、殼聚糖表面修飾的聚乳酸平面膜。結(jié)果顯示，PEI423和PEI25000對(duì)PLA平面膜模型進(jìn)行表面改性并引入殼聚糖，都具有可以提高材料的親水性能、有效引入活性氨基、提高細(xì)胞

8、相容性的作用。 (5)研究進(jìn)一步采用傳統(tǒng)的溶劑揮發(fā)法制備5-Fu的聚乳酸載藥微球，在優(yōu)化了微球制備工藝的基礎(chǔ)上考察了溶劑揮發(fā)法制備的5-Fu載藥微球的緩釋性能、表面形貌等，并嘗試對(duì)載藥微球進(jìn)行表面改性，包括表面胺解、接枝葉酸靶向基團(tuán)及熒光物質(zhì)FITC，并通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)并證明了葉酸的靶向介導(dǎo)作用及熒光素FITC的顯色作用，為聚乳酸微球在生物醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)一步功能化的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。制備的5-Fu載藥微球(DL-MS-PLA)得到了

9、有理想尺寸的粒徑，且具有明顯的藥物緩釋作用，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有很強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性，能基本達(dá)到要求。通過(guò)PEI表面改性并進(jìn)一步接枝葉酸后的5-Fu載藥微球(DL-MS-PLA-PEI-FA)具有較好的靶向性，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明DL-MS-PLA-PEI-FA比之前未改性的DL-MS-PLA明顯更多地聚集在腫瘤細(xì)胞附近，MTT試驗(yàn)也證實(shí)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。在熒光顯微鏡下觀察證實(shí)DL-MS-PLA-PEI-FA-FITC微球大量聚集在腫瘤

10、細(xì)胞周圍，F(xiàn)ITC的綠色熒光和同一視野中的細(xì)胞邊緣形貌吻合，說(shuō)明DL-MS-PLA-PEI-FA-FITC微球被Hela細(xì)胞吸附直至布滿了整個(gè)Hela細(xì)胞周圍。 (6)研究合成PLA-PEI兩親性載體和PLA-PEI-FA兩親性靶向載體并通過(guò)溶劑揮發(fā)法制備載藥微球、進(jìn)行表征；進(jìn)一步對(duì)微球接枝熒光物質(zhì)FITC直觀的考察了靶向修飾的微球?qū)?xì)胞的毒性和靶向等作用。研究合成的PLA-PEI與PLA-PEI-FA為兩親性共聚物，制備兩親性

11、MS-PLA-PEI與MS-PLA-PEI-FA微球具有核-殼結(jié)構(gòu)。MS-PLA-PEI微球粒徑小于100nm為納米級(jí)，粒徑分布窄，顆粒圓整，分散性良好；MS-PLA-PEI-FA粒徑普遍較大(約2-2.5μm左右)，顆粒表面有不規(guī)則突起。制備的兩親性PLA/PEI聚乳酸空白及葉酸靶向微球，核均由疏水的PLA鏈段組成，可以接納疏水的藥物；殼由親水的PEI或者PEI-FA鏈段組成，可以保護(hù)微粒表面不被血液中的蛋白質(zhì)吸附，從而到達(dá)微球在體內(nèi)

12、長(zhǎng)循環(huán)的目的。研究發(fā)現(xiàn)，由于PEI帶有大量帶正電的氨基，具備更好的細(xì)胞親和性，因此不同PLA/PEI配比、相同的載藥量的微球作用下，發(fā)現(xiàn)PEI含量多，相同培養(yǎng)條件下被藥物作用殺死的細(xì)胞越多，綠色熒光效果越明顯，有更加強(qiáng)烈的靶向和顯色效果；而PEI的投入量過(guò)少會(huì)導(dǎo)致靶向效果和熒光顯色效果欠佳。MTT試驗(yàn)也證明，不同濃度DL-MS-PLA-PEI-FA-FITC微球?qū)ela細(xì)胞的抑制作用，隨濃度增加開始顯現(xiàn)并漸次增強(qiáng)，濃度1mg/ml時(shí)抑