塞來(lái)昔布對(duì)結(jié)腸癌裸鼠移植瘤中β-CATENIN、VEGF和微血管密度（MVD）的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過(guò)建立結(jié)腸癌裸鼠種植瘤模型，給與COX-2抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)，檢測(cè)結(jié)腸癌裸鼠種植瘤中細(xì)胞Wnt信號(hào)通路中的樞紐分子β-連環(huán)素(β-catenin)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor.VEGF)的表達(dá)情況，檢測(cè)微血管密度(Microvessel density.MVD)；研究塞來(lái)昔布對(duì)結(jié)腸癌裸鼠種植瘤中β-連環(huán)素(β-catenin)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEG

2、F)及微血管密度(MVD)的影響。檢驗(yàn)塞來(lái)昔布抗腫瘤效果，探討其抗腫瘤的部分機(jī)制，為將來(lái)臨床應(yīng)用COX-2抑制劑提供前期準(zhǔn)備工作。 方法：購(gòu)買(mǎi)4～5周齡BALB/c雌性裸小鼠30只，體重20～24克，于無(wú)特定病原體(specified-pathogens free，SPF)環(huán)境下飼養(yǎng)，環(huán)境溫度、濕度適宜，無(wú)菌飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)。使用含10％新生牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的D/F12培養(yǎng)基，在37℃含5％

3、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞，用培養(yǎng)基配置成細(xì)胞密度為1×107/ml的細(xì)胞懸液。裸鼠皮膚消毒后用1ml注射器在頸部右側(cè)皮下接種上述細(xì)胞懸液0.2ml建立種植瘤模型，定期觀察，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，按公式V=ab2/2，計(jì)算腫瘤近似體積，16天后，腫瘤平均直徑達(dá)5mm，將裸小鼠隨機(jī)分為2組(塞來(lái)昔布組，對(duì)照組)，塞來(lái)昔布組給予塞來(lái)昔布混懸液40mg/kg/d，用小號(hào)灌胃針

4、灌胃給藥，對(duì)照組不予處理。給藥過(guò)程中注意抓持裸小鼠方法，固定小鼠，防治灌胃時(shí)小鼠掙扎，灌胃針損傷小鼠。 SPF環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)40天，每周測(cè)量小鼠的體重及腫瘤的體積，計(jì)算抑瘤率，給藥40天后，頸椎脫臼處死小鼠，切取種植瘤組織，部分置于4％多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)包埋切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。部分置于液氮中凍存?zhèn)溆?。?yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察COX-2、β-catenin的表達(dá)情況；通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)血管內(nèi)皮標(biāo)志性因子CD34來(lái)觀察腫

5、瘤中的微血管密度。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的VEGFmRNA的含量。各項(xiàng)指標(biāo)均與對(duì)照組比較，應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)。在塞來(lái)昔布組中，應(yīng)用直線(xiàn)相關(guān)分析方法，分析各指標(biāo)間有無(wú)相關(guān)性。結(jié)果： 1、30只裸鼠均成瘤，成瘤率100％，成瘤時(shí)間為細(xì)胞種植后第5-11天。腫瘤細(xì)胞種植后第16天，腫瘤直徑平均達(dá)5mm。實(shí)驗(yàn)結(jié)束切取瘤組織后，對(duì)裸鼠解剖未發(fā)現(xiàn)種植瘤肝轉(zhuǎn)移。 2、治療結(jié)束后，種植瘤體積分別為：對(duì)照組12

6、38±241mm3；塞來(lái)昔布組852±153mm3；塞來(lái)昔布能明顯抑制人結(jié)腸癌裸鼠種植瘤的生長(zhǎng)。塞來(lái)昔布組抑瘤率為32.54％。t檢驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，塞來(lái)昔布組種植瘤生長(zhǎng)緩慢(P＜0.05)。 3、COX-2陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞胞漿，呈棕黃色彌漫性分布，對(duì)COX-2免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行積分光密度測(cè)定，與對(duì)照組比較，塞來(lái)昔布組COX-2表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；β-catenin陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞胞膜/漿，呈棕黃色顆

7、粒狀，對(duì)β-catenin免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行積分光密度測(cè)定，與對(duì)照組比較，塞來(lái)昔布組β-catenin表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。 4、將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，加入VEGF-mRNA引物的可見(jiàn)約178bp的擴(kuò)增帶，加入GAPDH引物可見(jiàn)231bp的擴(kuò)增帶，對(duì)兩條帶進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布組VEGF-mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 5、免疫組織化學(xué)染色后對(duì)微血管熱區(qū)進(jìn)行計(jì)數(shù)，塞來(lái)昔布組M

8、VD值較對(duì)照組降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 6、塞來(lái)昔布組內(nèi)指標(biāo)比較顯示：COX-2與VEGF-mRNA和MVD之間成正相關(guān)關(guān)系(r＞0.9，P＜0.05)。β-catenin與VEGF-mRNA成正相關(guān)關(guān)系(r=0.95，P＜0.05)。 結(jié)論： 1、COX-2抑制劑塞來(lái)昔布明顯抑制結(jié)腸癌裸鼠種植瘤的生長(zhǎng)。 2、通過(guò)抑制β-catenin的異常表達(dá)，減少經(jīng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起的細(xì)胞增殖，抑