TPX2在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、食管癌(esophageal careinoma,EC)是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移傾向等生物學(xué)行為特點(diǎn),其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。食管癌分布具有鮮明的地理區(qū)域特點(diǎn),中國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū),而河南省是中國(guó)的高發(fā)省份。近年來(lái),由于手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、術(shù)前新輔助治療的開(kāi)展、同步放化療的應(yīng)用以及循證醫(yī)學(xué)研究方法的推廣,使得食管癌患者的生存期雖然明顯延長(zhǎng),生活質(zhì)量也有一定的改善,但目前食管癌術(shù)后五年生存率僅為20-3

2、5％,其療效尚不令人滿意。因此,深入探討食管癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制,進(jìn)而提高食管癌的診療水平,已成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　 TPX2(targeting protein for Xk1p2靶蛋白),又稱repp86(restricted expressedproliferation-associated protein86),是一種受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控的核增殖相關(guān)蛋白,參與細(xì)胞有絲分裂的紡錘體微管功能。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均表明TPX2過(guò)

3、表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中心體擴(kuò)增,出現(xiàn)DNA異倍體及多倍體,而腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖失控以及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān),推測(cè)TPX2可能在食管癌的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮作用,有關(guān)TPX2在食管癌中的表達(dá)及其與食管鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究,國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 為了解TPX2基因與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,尋找早期檢測(cè)食管鱗癌發(fā)生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)及抑制食管鱗癌發(fā)生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的有效方法,本文采用免疫組化SP法和RT-PCR等分子生物學(xué)技

4、術(shù),對(duì)食管鱗癌、不典型增生及正常食管黏膜組織等新鮮手術(shù)切除標(biāo)本中的TPX2 mRHA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),探討與食管癌疾病進(jìn)展的關(guān)系。應(yīng)用RNA干擾技術(shù),利用化學(xué)合成的針對(duì)TPX2的siRNA并用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染入EC9706細(xì)胞,采用免疫組化SP法、western blot、RT-PRC、細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)MTT法、TUNEL技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù),觀察轉(zhuǎn)染后EC9706細(xì)胞TPX2基因表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化,運(yùn)用

5、Boyden chamber侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞體外侵襲力的改變。最后又在建立裸鼠移植瘤模型的基礎(chǔ)上,采用RT-PCR、免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測(cè)了TPX2在裸鼠移植瘤中的表達(dá),對(duì)比觀察了RNA干擾對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。系統(tǒng)地從體內(nèi)、外兩個(gè)方面探討了TPX2在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其對(duì)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的影響,為食管癌的靶向基因治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 1.食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜組織中TPX2的表達(dá)
　　

6、 采用免疫組織化學(xué)以及RT-PCR檢測(cè)62例食管鱗癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織中TPX2蛋白及mRNA的表達(dá)并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞的胞核內(nèi),在正常食管粘膜組織、癌旁不典型增生組織和食管鱗癌組織中的表達(dá)水平依次逐漸升高,陽(yáng)性率分別為4.8％、51.6％、85.5％,三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且TPX2蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05

7、),而與食管癌的組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示正常食管上皮中TPX2 mRNA不表達(dá)或者弱表達(dá),在食管癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為65％,不典型增生癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為35.5％。食管癌組織中TPX2的表達(dá)顯著高于不典型增生組織及正常上皮組織(x2=20.037,P<0.001)。TPX2在癌旁不典型增生組織及癌組織中mRNA的含量分別為0.627±0.084、0.879±0.046,組間比較有明顯差異(F=13.999

8、,P<0.05),而且表達(dá)水平與食管癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。但是TPX2蛋白或mRAN表達(dá)均與食管癌患者的性別、年齡、大體類型及腫瘤發(fā)生部位無(wú)關(guān)(P>0.05).
　　 2.RNA干擾對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞株TPX2基因表達(dá)沉默的效果
　　 利用化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞,用脂質(zhì)Lipofectamine2000作為siTPX2的轉(zhuǎn)染介質(zhì),將EC9706細(xì)胞株分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和

9、siRNA干擾組?？瞻讓?duì)照組不予任何處理,陰性對(duì)照組加入包含非特異核昔酸序列的質(zhì)粒,干擾組加入實(shí)驗(yàn)篩選出的最有效干擾siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h應(yīng)用RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)各組TPX2 mRNA及蛋白的表達(dá)。采用四甲基偶氮哇鹽光吸收法(MTT法)檢測(cè)EC9706細(xì)胞活力,熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè),繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線以觀察siTPX2基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響,采用TUNEL標(biāo)

10、記技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡的數(shù)量變化,用流式細(xì)胞技術(shù)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化,并采用Boyden chamber實(shí)驗(yàn)計(jì)算各組穿膜的細(xì)胞數(shù)以比較轉(zhuǎn)染siTPX2基因?qū)?xì)胞侵襲能力變化的影響。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染siTPX2后24h、48h、72h、96h,EC9706細(xì)胞TPX2 mRNA以及蛋白的表達(dá)量與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較均顯著降低,且在72h最明顯。EC9706細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線在轉(zhuǎn)染siRNA后48h其增殖特性開(kāi)始受到抑制,72h

11、抑制作用最為明顯,而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較為接近未受明顯影響。TUNEL技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,與空白對(duì)照細(xì)胞組和陰性對(duì)照細(xì)胞組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞分裂受到抑制,G1期細(xì)胞減少而S期細(xì)胞增多,細(xì)胞周期阻滯在S期。Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA細(xì)胞組穿越Matrigel的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<

12、0.05),而陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組之間則無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 3.TPX2 siRNA對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　 分別將EC9706細(xì)胞組、陰性對(duì)照組(無(wú)關(guān)siRNA細(xì)胞組)和siRNA干擾組的食管癌細(xì)胞株EC9706注入裸鼠皮下,觀察裸鼠移植瘤的成瘤時(shí)間及成瘤率,比較各組裸鼠成瘤大小并應(yīng)用RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中TPX2的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC9706細(xì)胞組、

13、陰性對(duì)照組裸鼠移植瘤體積顯著大于siRNA干擾細(xì)胞組裸鼠移植瘤體積,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而且TPX2蛋白及mRNA表達(dá)顯著高于siRNA干擾組的表達(dá),組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.人TPX2基因的分子克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 用pQE-70-TPX2原核表達(dá)載體為基礎(chǔ),經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出人TPX2基因；限制性內(nèi)切酶SphI和BamHI雙酶

14、切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒,然后用T4 DNA Ligase連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子,挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),提取其質(zhì)粒,進(jìn)行SphI和BamHI雙酶切驗(yàn)證,并經(jīng)酶切鑒定,DNA序列證實(shí)獲得的TPX2基因測(cè)序及BLAST分析證明克隆的人TPX2基因序列正確,成功構(gòu)建了TPX2基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TPX2,為進(jìn)一步的研究TPX2的生理功能和與其相關(guān)基因的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　

15、結(jié)論
　　 1.首次發(fā)現(xiàn),TPX2蛋白及mRNA在食管不典型增生組織及食管鱗癌組織中呈高表達(dá),且與食管癌的浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),TPX2可能為腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的早期指標(biāo)。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)表明,siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞組可抑制EC9706細(xì)胞TPX2蛋白及mRNA的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力,將腫瘤細(xì)胞阻滯在S期并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示。siRNA干擾明顯降低裸鼠移植瘤TPX2基因表達(dá)量