正常與疾病心臟興奮—收縮偶聯(lián)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、第一章、KCNE2調(diào)節(jié)心臟L型鈣通道特性及其機(jī)制
　　 目的:眾所周知，KCNE2在維持心臟電生理的穩(wěn)定性中起著非常重要的作用。有研究報(bào)導(dǎo)，KCNE2的突變體與長(zhǎng)QT綜合癥及房顫/短QT綜合癥有著很明確的關(guān)系。而KCNE2作為鉀通道的一個(gè)β輔助亞基，其在調(diào)整電壓依賴性陽(yáng)離子通道中的具體功能非常復(fù)雜。在心臟中，L型鈣通道在動(dòng)作電位復(fù)極平臺(tái)期中又起著非常重要的作用，那么KCNE2是否能夠調(diào)節(jié)LCC的通道功能昵？目前還不得而知。因此，

2、這章節(jié)本研究了KCNE2在調(diào)節(jié)心臟的LCC通道中所起的作用及病理生理學(xué)意義。
　　 方法:分離15只成年SD大鼠（性別不限）心肌細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)，每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為四組:GFP、KCNE2、shRNA、shRNA-KCNE2，并記錄鈣電流及動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行分析，方差齊時(shí)，L型鈣電流密度、LCC的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在多組間的比較采用One-Way ANOVA方法，兩兩比較采用LSD法;方差不齊時(shí)，多組間比較

3、采用Welch檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunnett'T3方法;蛋白表達(dá)量采用單樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:L型鈣電流密度在四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.659，P＜0.001);在大鼠心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KCNE2時(shí)可以降低鈣電流密度峰值18％(P=0.008)，而低表達(dá)KCNE2則上調(diào)29％鈣電流密度峰值(P＜0.001)。改變KCNE2表達(dá)也可以改變LCC的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(F=4.288，P=0.007)

4、。過(guò)表達(dá)KCNE2引起電壓依賴性激活的正移(P＜0.001)，穩(wěn)態(tài)電壓依賴性失活過(guò)程左移，并使得LCC從失活后的恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.001)，而當(dāng)?shù)捅磉_(dá)KCNE2，LCC通道動(dòng)力學(xué)效應(yīng)則恰恰相反(P=0.003)。在異源表達(dá)系統(tǒng)HEK293細(xì)胞中，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可以得到同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。免疫共沉淀和免疫染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，不管是在心肌細(xì)胞還是在293細(xì)胞中，Cav1.2和KCNE2都存很好的共定位現(xiàn)象。另外，一種家族性房顫有著密切相關(guān)的KCN

5、E2突變體R27C，可以放大KCNE2對(duì)LCC的這種調(diào)控作用，過(guò)表達(dá)時(shí)對(duì)LCC的抑制作用更為強(qiáng)烈。
　　 結(jié)論:KCNE2與LCC的a亞基Cav1.2存在共定位現(xiàn)象，KCNE2并起著調(diào)節(jié)LCC通道功能。這種調(diào)節(jié)作用在維持心臟電穩(wěn)定性是非常重要的。KCNE2突變體R27C可以增強(qiáng)KCNE2調(diào)LCC作用，并可能通過(guò)部分抑制Ica,L和縮短動(dòng)作電位時(shí)程從而導(dǎo)致家族性房顫。
　　 第二章、虎杖苷對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈣調(diào)控和興奮收縮偶

6、聯(lián)的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制
　　 目的:探討虎杖苷對(duì)心肌細(xì)胞的鈣信號(hào)及興奮-收縮耦聯(lián)調(diào)控機(jī)制，從而探討虎杖苷介導(dǎo)的心臟保護(hù)作用。
　　 方法:急性分離18只SD大鼠（性別不限）心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為四組:control、1uM PD、10uM PD和100uM PD。使用膜片鉗技術(shù)觀察虎杖苷對(duì)L型鈣電流的影響，通過(guò)激光共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)虎杖苷對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈣火花發(fā)放頻率、鈣庫(kù)水平、鈣瞬變以及興奮-收縮偶聯(lián)效率的作用。
　　

7、 結(jié)果:
　　 1、方差分析結(jié)果顯示，鈣瞬變和收縮幅度在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)分別為:3.548和10.854，P值分別為0.015和＜0.001。微摩量級(jí)的虎杖苷可以降低收縮期鈣瞬變水平(P=0.021)，但同時(shí)增加心肌細(xì)胞收縮性(P=0.030)。
　　 2、心肌細(xì)胞L型鈣電流密度在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.545，P＜0.001)，不同虎杖苷呈濃度依賴性降低心肌細(xì)胞L型鈣電流密度(P分別為0.036，0.

8、006，＜0.001)。
　　 3、不同濃度的PD可以改變鈣火花的發(fā)放頻率(F=25.802，P＜0.001)?；⒄溶湛梢栽黾訂蝹€(gè)心肌細(xì)胞鈣火花的發(fā)放頻率(P均＜0.001)，同時(shí)降低肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)水平(P=0.017和P＜0.001)。
　　 4、10uM虎杖苷可增加興奮收縮偶聯(lián)效率(t=-14.404，P＜0.001)。
　　 5、不同的刺激下鈣電流幅度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.369，P＜0.001)，虎杖苷

9、可以抑制ISO引起的鈣電流幅度(P＜0.001)及鈣瞬變?cè)黾拥乃?P＜0.001)，然而不影響beta-AR正性心肌收縮力作用(P=0.865)。
　　 結(jié)論:虎杖苷通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分泌NO，降低L型鈣通道電流，增加雷諾丁受體反應(yīng)性及肌原纖維對(duì)鈣的敏感性，最終導(dǎo)致鈣瞬變水平降低而不影響心肌收縮力，即增加心肌興奮收縮偶聯(lián)效率。這提示我們虎杖苷在鈣調(diào)控紊亂相關(guān)的心臟疾病中具有潛在的心肌保護(hù)作用。
　　 第三章、燒傷血清對(duì)大鼠心

10、室肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制
　　 目的:心肌抑制因子早已被認(rèn)為存在于燒傷血清(BS)中，并在燒傷所致心功能障礙中起著重要的作用。然而，燒傷血清在心功能障礙的發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞和分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們研究了燒傷血清對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的鈣調(diào)控過(guò)程及心肌收縮力的作用及其機(jī)理。
　　 方法:急性分離10只成年SD大鼠（性別不限）心肌細(xì)胞，隨機(jī)分成3組:對(duì)照組，燒傷血清作用20min組和作用60min組，并分

11、別記錄鈣電流、鈣瞬變、鈣火花、鈣庫(kù)等鈣信號(hào)指標(biāo)。
　　 結(jié)果:通過(guò)給予1Hz場(chǎng)刺激心肌細(xì)胞，在給予燒傷血清的開始20min內(nèi)鈣瞬變幅度和心肌收縮力有所增加(F=25.738，P＜0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組相比，增加的幅度分別為:28.0％(P＜0.001)和34.7％(P＜0.001)。隨著燒傷血清作用時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣瞬變的幅度和心肌收縮力反而有所下降(F=24.609，P＜0.001)，與對(duì)照組相比，在作用60分鐘

12、后分別下降了20.5％(P＜0.001)和32.3％(P＜0.001)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在燒傷血清作用的開始階段(前20min)肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)容量水平并沒(méi)有改變(P=0.781)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣火花發(fā)放的增加(F=22.898,P＜0.001)，鈣庫(kù)容量水平也有所改變(F=32.299，P＜0.001)，BS作用60min時(shí)與對(duì)照組相比SRload下降了32.0％(P＜0.001)。肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)水平的變化與鈣瞬變以及心肌收縮力的變化是相符

13、的。在給予燒傷血清刺激的整個(gè)過(guò)程，自發(fā)鈣火花和自發(fā)鈣波發(fā)放頻率方差分析結(jié)果顯示組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值分別為:39.784和22.898，P均＜0.001，主要表現(xiàn)為發(fā)放頻率增加（P均＜0.001）。然而這種過(guò)度活躍的鈣火花和鈣波可以通過(guò)抗氧化(vitamin A，0.2 mM; and vitamin E，1 mM)治療來(lái)抑制。通過(guò)抗氧化干預(yù)，燒傷血清引起鈣火花發(fā)放頻率增加的效應(yīng)受到抑制，燒傷血清引起的心肌細(xì)胞鈣瞬變(F=0.305，P

14、=0.821)及心肌收縮力的改變(F=0.284，P=0.837)也恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論:燒傷血清引起的雙向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)作用與氧化應(yīng)激所致雷諾丁受體高反應(yīng)性存在很大關(guān)系，在作用的始起階段，胞內(nèi)鈣釋放的增加引起了興奮收縮偶聯(lián)的提高，在作用的末階段，鈣火花介導(dǎo)的鈣漏流導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)容量部分耗竭，最后引起心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)的下降，心肌收縮力降低。
　　 第四章、虎杖通過(guò)減少雷諾丁受體的氧化修飾來(lái)抑制肌漿網(wǎng)Ca2

15、+泄漏從而保護(hù)燒傷大鼠心功能
　　 目的:前期的工作證實(shí)，燒傷引起的心臟中肌漿網(wǎng)鈣漏流主要是由于雷諾丁受體活性過(guò)度活躍。肌漿網(wǎng)鈣漏流進(jìn)而引起肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)水平下降，并引起胞內(nèi)鈣紊亂，最終引發(fā)燒傷心功能障礙的病理變化。在這一章中，我們著重研究了虎杖苷（白藜蘆醇的葡萄糖苷形式）通過(guò)抑制肌漿網(wǎng)鈣漏流所致燒傷所致心功能障礙中的作用及其機(jī)理。
　　 方法:28只SD大鼠隨機(jī)分成四組:對(duì)照，虎杖苷組，燒傷組和燒傷十虎杖苷組。燒傷組制作3

16、0％體表面積燒傷大鼠模型。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行分析，方差齊時(shí)，多組間的比較采用One-Way ANOVA方法，兩兩比較采用LSD法;方差不齊時(shí)，多組間比較采用Welch檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunnett'T3方法。以P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:方差分析結(jié)果顯示:組間心功能各指標(biāo)（LVSP、±dp/dt在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值分別為77.726、41.798和82.672，P值均＜0.001）

17、。傷后給予虎杖苷治療可以很好地改善燒傷大鼠心功能(P＜0.001)。虎杖苷可以改善燒傷后大鼠心肌細(xì)胞的鈣瞬變(P＜0.001)及心肌收縮力(P＜0.001)。各組鈣火花發(fā)放水平方法分析顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=15.871，P＜0.001。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重?zé)齻梢砸鹦募〖?xì)胞中雷諾丁受體活性增加，自發(fā)鈣火花發(fā)放頻率的增加(P＜0.001)，而鈣火花發(fā)放的過(guò)多則會(huì)引起肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)水平下降(P＜0.001)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞里

18、RyR2通道中的自由巰基含量（通過(guò)mBB熒光信號(hào)反映）在燒傷所致的心功能障礙大鼠中降低(P＜0.001)。燒傷后及時(shí)給予虎杖苷治療可以降低心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P=0.008)，最后恢復(fù)RyR2通道中的自由巰基含量(P=0.009)。伴隨而來(lái)的結(jié)果是，虎杖苷糾正了鈣火花介導(dǎo)的肌漿網(wǎng)鈣漏流，并恢復(fù)其鈣庫(kù)容量水平。收縮期鈣瞬變幅度和心肌收縮力通過(guò)PD治療后得到明顯的改善。
　　 結(jié)論:本研究提示我們虎杖苷通過(guò)減少Ryr2通道中的氧化