體外抗鴿源禽毛滴蟲中藥的篩選及其作用機(jī)理研究.pdf

1、鴿毛滴蟲病是由鞭毛蟲禽毛滴蟲（Trichomonas gallinae）引起的，是危害鴿子最重要的疾病之一，給世界養(yǎng)鴿業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。T.gallinae通常寄生于各種鳥類上消化道導(dǎo)致黏膜炎癥、潰瘍，甚至因肉芽腫阻塞食道而造成宿主饑餓死亡。甲硝唑、地美硝唑、替硝唑等硝基咪唑類藥物被認(rèn)為是預(yù)防和治療鴿毛滴蟲病最主要的藥物。然而隨著化學(xué)藥物的使用，藥物殘留、藥物毒副作用及耐藥株的產(chǎn)生等問題不斷出現(xiàn)，關(guān)于硝基咪唑藥物的使用也引起了更多

2、關(guān)注和質(zhì)疑。因此，篩選具有抗T.gallinae活性的新型低毒藥物來減少或替代合成藥物的使用成為研究熱點(diǎn)之一。目前，基于自然界天然產(chǎn)物及其衍生物的藥物已占醫(yī)藥市場的30％以上，其中，中藥以天然植物居多，因具有品種繁多、價(jià)格低廉、無污染、毒副作用小、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到更多青睞。金蓮花是我國常見中草藥之一，其在臨床上多用于治療上呼吸道感染、咽炎、泌尿系統(tǒng)感染、細(xì)菌性痢疾等疾病，且對細(xì)菌、病毒、陰道毛滴蟲等均有一定抑制和殺

3、滅作用，是一種具有多種醫(yī)藥功效的中藥。研究表明，雞冠花不僅可用于肝損傷如肝纖維化、肝硬化和肝癌的治療，而且，對治療陰道毛滴蟲和提高動物機(jī)能也有顯著效果，是一味良好的中藥。研究表明，利用單味中藥之間發(fā)揮的協(xié)同作用組成中藥復(fù)方對鴿毛滴蟲病的治療有顯著效果。本研究首先對分離的T.gallinae體外培養(yǎng)體系進(jìn)行建立。隨后從具有殺蟲、抑菌、清熱解毒等作用的中藥中篩選了具有抗T.gallinae活性的中藥金蓮花、雞冠花及兩個中藥復(fù)方。然后通過活蟲

4、體計(jì)數(shù)法測定藥物對T.gallinae的IC50、通過MTT法測定藥物對CEF的TC50，從而確定藥物的選擇指數(shù)。最后對藥物引起T.gallinae死亡的機(jī)理進(jìn)行研究。試驗(yàn)具體分為以下4個部分:
　　1.T.gallinae的分離、鑒定及體外培養(yǎng)
　　本研究自患病鴿口腔分離到疑似T.gallinae的蟲體，通過臨床癥狀、病理變化、病原學(xué)診斷及分子生物學(xué)診斷確診為T.gallinae，在含抗生素的HF培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)后獲得純培

5、養(yǎng)的T.gallinae，并對其生長曲線進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，蟲體轉(zhuǎn)種時(shí)以1.5×105個/mL為初始密度在HF培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)36h～60h時(shí)處于對數(shù)增長期。
　　2.篩選具有體外抗T.gallinae活性的中藥
　　試驗(yàn)證明，在試驗(yàn)中藥中，金蓮花、雞冠花、花椒、香薷水煎劑(MLCs=100mg/mL)相對其他試驗(yàn)藥物有較高的抗T.gallinae活性，青蒿、蛇床子、白頭翁水煎劑(MLCs=200mg/mL)對T.g

6、allinae有一定抑制或殺滅作用，而苦參、千里光、荊芥、貫眾、仙鶴草、常山水煎劑(MLCs≧400mg/mL)需要較大劑量才能殺滅全部蟲體，對T.gallinae的作用較小。
　　3.T.gallinae體外藥敏試驗(yàn)及選擇指數(shù)的確定
　　利用活蟲體計(jì)數(shù)法，分別測定了甲硝唑、地美硝唑、雞冠花、金蓮花及兩個中藥復(fù)方A和B體外不同時(shí)間、濃度對T.gallinae的相對抑制率。結(jié)果表明，本試驗(yàn)分離的T.gallinae對甲硝唑、地

7、美硝唑均具有耐藥性，但對地美硝唑相對更敏感。金蓮花、雞冠花、復(fù)方A和復(fù)方B體外作用48h對蟲體的IC50分別為0.91、0.34、0.26、0.39mg/mL，四種藥物的抗蟲活性復(fù)方A＞雞冠花＞復(fù)方B＞金蓮花。利用MTT法對金蓮花、雞冠花、復(fù)方A和復(fù)方B水提物體外作用48h對CEF的TC50進(jìn)行測定，分別為1.91、1.80、7.06、9.09mg/mL，通過IC50和TC50確定藥物的SI(TC50/IC50)。結(jié)果顯示:金蓮花水提物

8、具有低選擇性(SI=2.10)、雞冠花水提物具有顯著選擇性(SI=5.34)、復(fù)方A(SI=27.37)和復(fù)方B水提物(SI=23.30)不具有體外細(xì)胞毒性。
　　4.各藥物造成T.gallinae死亡的機(jī)理
　　通過藥物對蟲體形態(tài)、核、散射光、線粒體膜電位及凋亡的影響判斷藥物造成T.gallinae死亡的機(jī)理。結(jié)果表明，甲硝唑和金蓮花水提物作用的T.gallinae變圓，蟲體核被破壞產(chǎn)生凋亡小體，但膜仍保持完整，內(nèi)容物不發(fā)