重組慢病毒載體介導(dǎo)造血干細(xì)胞途徑的血友病B基因治療研究.pdf

1、本研究采用重組慢病毒為載體，感染小鼠造血干細(xì)胞，然后將其移植到經(jīng)同位素輻射破壞自身造血功能的NOD/SCID鼠中，以期提高h(yuǎn)FIX在動物模型的表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間，為今后臨床試驗(yàn)打下基礎(chǔ)?！　≡诒卷?xiàng)研究中，作者采用由Ubiquitin(泛素)啟動子調(diào)控的GFP(綠色熒光蛋白)基因和人凝血因子IX基因的重組慢病毒載體FUGW、FUXW。通過磷酸鈣三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法制備出高滴度的重組慢病毒?！　「腥綟UGW慢病毒的293T、Vero、He

2、la細(xì)胞72h后均可觀察到熒光。重組FUXW慢病毒通過尾靜脈注射入血友病B小鼠，表達(dá)最高峰值為30.7ng/mL,表達(dá)持續(xù)超過49天?！　》蛛x小鼠骨髓中單個有核細(xì)胞，體外培養(yǎng)并感染重組FUGW和FUXW慢病毒，一周后流式測得GFP陽性率12.1％，hFIX表達(dá)量為41.7±4.2ng/ml(ICR鼠)和34.5±6.5ng/ml(C57鼠)。通過免疫磁珠法(MACS)進(jìn)一步分離小鼠造血干細(xì)胞lin-c-kit+，添加細(xì)胞因子短暫體外培

3、養(yǎng)并感染重組FUGW和FUXW慢病毒，一周后測得GFP陽性率為25.1％(加細(xì)胞因子)和16.6％(不加細(xì)胞因子)，hFIX表達(dá)量為46.6±5.7ng/ml(加細(xì)胞因子)和33.3±4.8ng/ml(不加細(xì)胞因子)?！　「腥局亟MFUGW和FUXW慢病毒的造血干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植到經(jīng)60Co亞致死劑量輻射的NOD-SCID鼠中。前者移植后6-8周處死，分離外周、骨髓和脾臟細(xì)胞，觀察GFP在造血干細(xì)胞及其分化子代細(xì)胞中的表達(dá)；后者移植后一