大蒜油拮抗2，5-己二酮脂質(zhì)過氧化和抑制正己烷代謝活化研究.pdf

1、正己烷（n—hexane）作為一種有機(jī)溶劑，工業(yè)應(yīng)用廣泛。環(huán)境中的正己烷經(jīng)呼吸道、消化道、皮膚進(jìn)入機(jī)體后，主要分布在脂肪含量較高的器官，如腦、腎、肝、脾、睪丸、血液等。在急性毒性分級(jí)中，正己烷屬無毒類，但因其揮發(fā)性大、脂溶性高，并有蓄積作用，被考慮為高危害性毒物；且正己烷急慢性中毒具有不同的表現(xiàn)：人類正己烷急性中毒主要表現(xiàn)為急性腦病（中樞性抑制）和皮膚、粘膜刺激癥；慢性中毒以神經(jīng)毒性為主，主要表現(xiàn)為由于遠(yuǎn)端粗大神經(jīng)纖維軸突退變而引起的感

2、覺—運(yùn)動(dòng)型周圍神經(jīng)病。目前對(duì)正己烷中毒引起的神經(jīng)毒作用尚沒有特異的治療方法。 已知正己烷對(duì)染毒動(dòng)物肝臟和神經(jīng)組織具有明顯的脂質(zhì)過氧化損傷（lipid peroxidation damage，LPD）作用，引起過氧化產(chǎn)物含量升高及氧化—抗氧化酶活性改變，由此推測過氧化損傷可能是正己烷的中毒機(jī)制之一。大蒜油（garlic oil，GO）是從大蒜中提取的一類與水不相混溶的油狀物，其主要成分為具有強(qiáng)還原性的各種硫化物，過氧化物及氧等均可

3、被其還原，進(jìn)而顯著提高機(jī)體過氧化物酶的活性和降低過氧化產(chǎn)物的含量。2，5—己二酮（2，5—hexanedione，2，5—HD）作為正己烷的活性代謝產(chǎn)物，是正己烷神經(jīng)毒性的主要介質(zhì)。大蒜油是否能夠拮抗2，5—HD導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)組織過氧化損傷，并減輕其引起的周圍神經(jīng)毒性國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì) Wistar雄性大鼠連續(xù)6周腹腔注射2，5—HD300mg/kg．bw染毒，制造正己烷慢性中毒致神經(jīng)毒性模型，并對(duì)染毒大鼠每天提前4—6小時(shí)分別

4、灌胃給予40mg/kg．bw和80mg/kg．bw大蒜油進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，給藥期間測定不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變：后肢撐力指數(shù)、平衡指數(shù)和步態(tài)評(píng)分；并測定實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)大鼠大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)的氧化—抗氧化狀態(tài)：丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、總抗氧化能力（total antioxidant capability，T—AOC）和抑制羥自由基能力，以觀察大蒜油對(duì)2，5—HD

5、導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化損傷和神經(jīng)毒性的作用。 正己烷的神經(jīng)毒性主要由其代謝產(chǎn)物2，5—HD所致，細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是正己烷的基本氧化代謝酶，在其代謝活化過程中起著重要作用；已有大量報(bào)道大蒜油對(duì)細(xì)胞色素P450具有明顯抑制作用，并在多種動(dòng)物疾病模型中得到驗(yàn)證，但大蒜油對(duì)正己烷代謝的影響至今尚未見相關(guān)報(bào)道。有研究顯示血清中的2，5—HD水平與其靶器官坐骨神經(jīng)中的含量呈明顯正相關(guān)，并與正己烷的神

6、經(jīng)毒性關(guān)系密切，因此降低血清中的2，5—HD水平，將可能減少正己烷中毒的發(fā)生，并可反映正己烷代謝水平的改變。為了滿足本實(shí)驗(yàn)對(duì)血清2，5—HD的測定要求，我們采用乙酸乙酯做萃取劑，并以無水碳酸鉀（K2CO3）進(jìn)一步提高其萃取效率，建立經(jīng)HP—5毛細(xì)管氣相色譜柱分離，氫火焰離子化檢測器（FID）檢測血清中2，5—HD的氣相色譜方法，并對(duì)該方法的可行性進(jìn)行了檢驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一次灌胃給予昆明種小鼠正己烷3000mg/kg．bw，干預(yù)組小鼠

7、于染毒前2小時(shí)給予80mg/kg．bw大蒜油，測定染毒后不同時(shí)點(diǎn)血清中2，5—HD含量、經(jīng)不同劑量大蒜油（10mg/kg．bw、20mg/kg．bw、40mg/kg．bw、80mg/kg．bw）干預(yù)及染毒前后2小時(shí)分別給予80mg/kg．bw大蒜油，染毒后6小時(shí)血清中2，5—HD含量較單純?nèi)径拘∈蟮母淖?；并?duì)不同性別和周齡小鼠經(jīng)同劑量正己烷染毒后血清2，5—HD含量進(jìn)行測定，探討大蒜油對(duì)正己烷代謝的影響，及性別和年齡因素對(duì)正己烷毒性的作

8、用，從而為預(yù)防正己烷中毒提供可行性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 結(jié)果: 1．體重變化 正常組大鼠體重穩(wěn)定增長；模型組和大蒜油組體重增長均減緩，甚至出現(xiàn)負(fù)增長，模型組大鼠染毒3周后體重顯著低于正常對(duì)照大鼠（P<0．01）；大蒜油低劑量組2周后，大蒜油高劑量組1周后體重即明顯低于模型大鼠（P<0．01或P<0．05）。 2．大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變 （1）步態(tài)及評(píng)分：大蒜油低、高劑量組大鼠染毒第4周即出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)異常表現(xiàn)，較模型

9、組大鼠提前一周；各組步態(tài)評(píng)分，模型組、大蒜油低、高劑量組較對(duì)照組均顯著升高（P<0．01），且大蒜油高劑量組得分較模型組顯著增高（P<0．05）。 （2）后肢撐力指數(shù)：與2，5—HD染毒0周比較，至第4周模型組、大蒜油低、高劑量組后肢撐力指數(shù)分別增長44％、50％、49％，均明顯高于正常對(duì)照組大鼠（P<0．01），但三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 （3）平衡指數(shù)：除對(duì)照組外，各組大鼠平衡指數(shù)均呈不同程度的降低

10、，至染毒第4周模型組、大蒜油低、高劑量組分別降低30％、45％、68％，均顯著低于正常對(duì)照組（P<0．05或0．01），且大蒜油高劑量組與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．05）。 3．大鼠各神經(jīng)組織氧化—抗氧化指標(biāo)的改變 （1）MDA含量變化：模型組大鼠的大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)中MDA含量分別較正常對(duì)照大鼠增加26％、25％和17％（P<0．05或0．01），而大蒜油組較模型組減少32％～43％（P<0．01）和32％～5

11、2％（P<0．01）。 （2）T—AOC的改變：模型組大鼠各神經(jīng)組織T—AOC較對(duì)照組有所增強(qiáng)，但各組間均沒有統(tǒng)計(jì)差異（P>0．05）。 （3）GSH含量改變：在各神經(jīng)組織中，模型組大鼠GSH含量低于正常對(duì)照組，除大蒜油低劑量組大鼠坐骨神經(jīng)中含量低于模型組外，其他各神經(jīng)組織大蒜油組均高于模型組，但以上改變均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 （4）抑制羥自由基能力：與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠抑制羥自由基能力在大腦、

12、脊髓和坐骨神經(jīng)分別削弱34％、16％和28％（P<0．05或0．01）；大蒜油不同程度的拮抗了這一趨勢，大蒜油低劑量組大鼠分別較模型組增強(qiáng)22％、28％和28％（P<0．01），大蒜油高劑量組則為50％、46％和40％（P<0．01）。 4．小鼠血清中2，5—HD含量的改變 （1）一次染毒代謝情況：一次性灌胃給予正己烷4000mg/kg．bw后，小鼠血清中2，5—HD含量隨時(shí)間推移而增加，至10小時(shí)達(dá)峰值后逐漸降低，20

13、小時(shí)后幾乎不能檢出。 （2）不同劑量正己烷染毒后血清2，5—HD含量的改變：小鼠血清中2，5—HD含量隨著正己烷染毒劑量的增加而增加，空白小鼠血清未檢出；2000、4000和6000mg/kg．bw組小鼠，染毒8小時(shí)后血清中2，5—HD含量分別為8．04、16．68和22．38μg/ml，呈明顯的劑量——效應(yīng)關(guān)系。 （3）大蒜油對(duì)正己烷染毒小鼠代謝的影響：經(jīng)3000mg/kg．bw正己烷一次灌胃染毒后，染毒組與大蒜油干預(yù)

14、組小鼠血清2，5—HD含量變化趨勢與4（1）結(jié)果一致，均隨時(shí)間延長先升高后降低；但大蒜油干預(yù)組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清含量均低于單純?nèi)径拘∈螅渲腥径竞?、6、8、10小時(shí)較染毒組2，5—HD含量顯著降低（P<0．05或0．01）。 （4）不同劑量大蒜油對(duì)小鼠血清中2，5—HD含量的影響：染毒前2小時(shí)給予不同劑量大蒜油，染毒后6小時(shí)小鼠血清2，5—HD含量分別較染毒組減少16．2％、20．8％、22．8％（P<0．05）和32．1％（P

15、<0．01），顯示明顯劑量—效應(yīng)關(guān)系。 （5）不同時(shí)間給予大蒜油對(duì)小鼠血清中2，5—HD含量的影響：正己烷染毒前后2小時(shí)分別給予小鼠80mg/kg大蒜油，其血清中2，5—HD含量與單純?nèi)径窘M相比均明顯降低（P<0．05）；且染毒前給藥組較染毒后給藥組要低，但兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 （6）不同周齡小鼠血清中2，5—HD含量：不同周齡小鼠經(jīng)同劑量正己烷一次性染毒8小時(shí)后，血清2，5—HD呈現(xiàn)不同水平（P<

16、0．05）：5周齡組（22．83μg/ml）高于4周齡（19．59μg/ml）和6周齡小鼠（16．42μg/ml）。 （7）不同性別小鼠血清2，5—HD含量：不同性別小鼠經(jīng)單次正己烷染毒后，雌鼠血清2，5—HD含量（13．22μg/ml）明顯高于雄鼠（10．34μg/ml），增高27．9％（P<0．05）。 5．小鼠血清2，5—HD的氣相色譜測定 結(jié)論: 1．大蒜油可拮抗2，5—HD所致的大鼠神經(jīng)組織脂質(zhì)

17、過氧化損傷，但不能改善大鼠感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能異常，由此推測過氧化損傷可能不是2，5—HD中毒性神經(jīng)病變的主要作用機(jī)制。 2．大蒜油可抑制正己烷染毒小鼠2，5—HD的產(chǎn)生，使血清2，5—HD水平明顯降低，且該抑制作用與大蒜油給藥劑量和時(shí)間有關(guān)；同時(shí)年齡和性別因素對(duì)正己烷代謝也具有一定的影響，以上為我們預(yù)防和減少正己烷中毒提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 3．本實(shí)驗(yàn)建立的2，5—HD氣相色譜測定方法，準(zhǔn)確可靠，具有良好的重現(xiàn)性，可用于小