IL-9+CD4+T細(xì)胞-IL-9與幽門螺桿菌感染的相關(guān)性研究和γδT細(xì)胞在金黃色葡萄球菌肺炎的宿主應(yīng)答中的作用.pdf

1、第一部分，幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是彎曲、棒狀的革蘭陰性桿菌,主要定植在胃部和十二指腸部位(1)。近年來的大量研究證明,幽門螺桿菌可引發(fā)人群中不同程度的急性或慢性胃炎,少數(shù)發(fā)展為消化性潰瘍和胃癌(2)。其中按是否含有細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(cytotoxinassociatedprotein,CagA)將幽門螺桿菌分為Ⅰ型和Ⅱ型。在臨床大多數(shù)胃炎病例中,胃體萎縮性胃炎是由Ⅰ型H.pylori感染引起

2、的主要臨床胃炎類型,并與胃癌的發(fā)生高度相關(guān)。CagA依賴于Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretionsystem,T4SS),轉(zhuǎn)運至胃粘膜上皮細(xì)胞并發(fā)生磷酸化,從而激活下游細(xì)胞信號通路,發(fā)揮細(xì)胞免疫學(xué)功能,引起胃上皮細(xì)胞“蜂巢”型形態(tài)學(xué)改變和更嚴(yán)重的感染癥狀(3,4)。受到刺激的上皮細(xì)胞釋放大量炎癥趨化因子和細(xì)胞因子等誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。已有文獻(xiàn)報道,H.pylori作為胞外菌可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生以CD4+T細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答反應(yīng)

3、,CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在H.pylori感染的機(jī)體免疫炎性損傷和抗感染免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用(5)。細(xì)胞因子IL-9是Uyttenhove等(6)人于1988年在Th2細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞生長因子,它具有多效性的免疫功能。2011年Stephens等人在自身免疫性胃炎疾病中發(fā)現(xiàn)Th17分泌的IL9通過刺激粘膜肥大細(xì)胞增殖間接抑制Th17的免疫活性,起到一定的抗炎的作用,且提出IL-9最終發(fā)揮促炎還是抗炎功能的重要因素是由疾病造成的微環(huán)境所

4、決定(7)。近年來,已有多篇文獻(xiàn)報導(dǎo)IL-9功能具有雙重性,一方面IL-9激活巨噬細(xì)胞,肥大細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞起到促進(jìn)炎癥和過敏反應(yīng);另一方面IL-9負(fù)向調(diào)節(jié)病毒介導(dǎo)的炎癥和增強(qiáng)天然Treg細(xì)胞免疫抑制活性。在哮喘小鼠模型中,Arnold等通過誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞揭示幽門螺旋桿菌感染能夠降低哮喘嚴(yán)重程度,提示幽門螺旋桿菌感染可能與哮喘程度存在負(fù)相關(guān)(8)。綜上,CD4+T細(xì)胞參與宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng),其中細(xì)胞因子IL-9是否也參與機(jī)體免疫應(yīng)答以

5、及發(fā)揮怎樣的免疫調(diào)節(jié)功能尚不清楚。
　　本課題將以IL-9+CD4+T細(xì)胞為主要研究對象,在H.pylori/B0菌株感染野生型(widetype,WT)BALB/c小鼠和IL-9基因敲除(IL-9ko)小鼠的模型下,初步研究IL-9+CD4+T細(xì)胞/IL-9與幽門螺桿菌感染的相關(guān)性研究,將為深入探討IL-9+CD4+T細(xì)胞在H.pylori自然感染條件下發(fā)揮復(fù)雜的免疫學(xué)功能提供新的參考和指導(dǎo)。
　　方法：
　　1.H

6、.pylori菌株感染受檢者血標(biāo)本中細(xì)胞因子檢測
　　收集了臨床受檢者的血清,通過檢測血清中抗H.pylori特異性抗體把標(biāo)本分為H.pylori感染陽性和陰性2組,通過ELISA方法檢測人外周血清中IL-9蛋白水平的表達(dá)。
　　2.IL-9在幽門螺桿菌感染小鼠模型中的表達(dá)檢測
　　(1)H.pylori/B0菌株感染BALB/c、IL-9ko小鼠模型建立方法(2)IL-9在幽門螺桿菌感染小鼠模型中動態(tài)表達(dá)檢測

7、　　3.IL-9在幽門螺桿菌感染小鼠模型中功能的初步研究(1)H.pylori/B0在小鼠胃內(nèi)定植量水平檢測
　　(2)胃組織炎癥評分及病理HE染色結(jié)果分析4.IL-9在幽門螺桿菌感染中的細(xì)胞來源研究
　　(1)幽門螺桿菌患者外周血產(chǎn)IL-9的T細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究
　　(2)幽門螺桿菌感染小鼠脾臟產(chǎn)IL-9的T細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究
　　結(jié)果：
　　1.臨床血清標(biāo)本中細(xì)胞因子IL-9在H.pylori感染陰性受

8、檢者中表達(dá)明顯高于H.pylori感染陽性受檢者。
　　2.相對于H.pylori/B0未感染組,野生型小鼠背景的H.pylori感染組的胃部H.pylori/B0定植在在感染后各個時間點明顯增高。結(jié)果證明H.pylori感染小鼠的動態(tài)評價模型建立成功。28天時,H.pylori/B0菌株感染BALB/c與未感染對照組相比,細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ和IL-10的mRNA水平都有顯著提高,相比之下IL-10和IFN-γ增加更明

9、顯。而感染組IL-9的mRNA水平較未感染組顯著下降。
　　3.BALB/c小鼠在H.pylori/B0菌株感染后的第28天胃內(nèi)定植量達(dá)到最高值,其前后一周內(nèi)維持在較高水平,但35d后定植量開始逐漸下降。IL-9ko感染組小鼠胃組織內(nèi)定植量水平高于BALB/c小鼠感染組,在感染后第28天檢測胃內(nèi)定植量也達(dá)到峰值。IL-9ko小鼠在敲除細(xì)胞因子IL-9后,H.pylori/B0菌株感染小鼠胃粘膜組織的定植量比WT感染組小鼠高。在相同

10、實驗條件下,觀察HE染色病理切片,IL-9ko感染組胃固有層部位炎癥細(xì)胞侵潤比WT感染組更多且胃粘膜表面局部有少量壁細(xì)胞破損。
　　4.H.pylori菌株感染陰性受檢者和陽性受檢者PBMC中的IL-9+CD4+T細(xì)胞占CD4T淋巴細(xì)胞的比例分別為1.9％和0.914%,統(tǒng)計結(jié)果也顯示陰性受檢者組IL-9+CD4+T細(xì)胞比陽性受檢者組多。在小鼠體內(nèi)再次驗證以上結(jié)果,H.pylori.B0菌株感染陰性小鼠和陽性小鼠脾單個核細(xì)胞中的I

11、L-9+CD4+T細(xì)胞占CD4T淋巴細(xì)胞的比例分別為0.7%和0.31%,統(tǒng)計結(jié)果也顯示陰性受檢者組IL-9+CD4+T細(xì)胞比陽性受檢者組多。且加入適當(dāng)細(xì)胞因子可誘導(dǎo)IL-9+CD4+T細(xì)胞的分泌IL-9。
　　結(jié)論：
　　1.H.pylori感染人和動物體后,細(xì)胞因子IL-9在轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞水平都下降。在WT和IL-9ko小鼠感染模型中,驗證IL-9與H.pylori/B0引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。
　　2.在H.py

12、lori感染后引起的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)中,T細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化后,IL-9可以來自于細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化下的Th9細(xì)胞。
　　第二部分，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus,S.aureus)是一種有鞭毛、無芽胞、多數(shù)無莢膜的革蘭陽性胞外細(xì)菌,顯微鏡下形態(tài)為圓球型,直徑約0.8μm,葡萄串狀(1)。金黃色葡萄球菌是人類重要的致病菌,可引發(fā)從皮膚和軟組織感染到侵襲性感染疾病,包括肺炎、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、菌血癥、心內(nèi)

13、膜炎和蜂窩織炎等。由金黃色葡萄球菌引起的肺炎占醫(yī)源性肺炎和社區(qū)性肺炎的比例分別為20-50%和25.5%,導(dǎo)致嚴(yán)重的肺內(nèi)感染,具有高發(fā)病率及高死亡率(2,3)。金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的多種毒素和侵襲性酶,包括:血漿凝固酶、葡萄球菌溶血素、殺白細(xì)胞素、腸毒素、表皮溶解毒素、毒性休克綜合毒素Ⅰ和葡激酶。近年來,金黃色葡萄球菌和甲氧西林易感金黃色葡萄球菌感染引起后天免疫性群體耐甲氧西林金黃色葡萄球(community-ac

14、quiredmethicillin-resistantS.aureus,CA-MRSA),它能抵抗人類目前所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,給臨床治療帶來很大困難,引起人們的高度重視。
　　在固有性免疫應(yīng)答中,根據(jù)TCR雙肽鏈結(jié)構(gòu)的不同,可將T細(xì)胞分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞兩類。其中γδT細(xì)胞在人和動物體內(nèi)表達(dá)量較少,主要分布在皮膚和呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)等黏膜組織部位。多數(shù)γδT細(xì)胞表面不表達(dá)MHCI和MHCII類分子自身識別的CD8

15、和CD4共受體分子。ΓδT細(xì)胞是固有免疫和獲得性免疫聯(lián)系的橋梁,具有免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤細(xì)胞識別等功能。在細(xì)菌感染的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)中,γδT細(xì)胞發(fā)揮重要功能,是固有免疫的第一道防線。根據(jù)細(xì)胞因子分泌的不同可分為兩種的Vγ1+和Vγ4+細(xì)胞亞群。
　　金黃色葡萄球菌感染可引起宿主體內(nèi)的固有性免疫應(yīng)答反應(yīng),入侵的病原微生物入可誘導(dǎo)宿主大量的中性粒細(xì)胞被募集到感染部位清除病原菌(4)。盡管肺部的γδT細(xì)胞只占據(jù)固有性免疫細(xì)胞中的一

16、小部分,但他們在病原微生物入侵中是抵御病原微生物的第一道防線。根據(jù)文獻(xiàn)報道,在肺炎克雷伯氏菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌引起的肺部感染,去除γδT細(xì)胞可降低宿主免疫保護(hù)功能,導(dǎo)致更嚴(yán)重的肺組織炎癥損傷。而γδT細(xì)胞在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的皮膚病中具有重要作用。近年來,γδT細(xì)胞在金黃色葡萄球菌感染的肺組織炎癥中的免疫應(yīng)答作用和機(jī)制還未見報道。
　　為了研究γδT細(xì)胞在急性金黃色葡萄球菌肺炎中的作用,本課題建立金黃色葡萄球菌株感染的野生

17、型(WT)C57BL/6小鼠和TCR-δ?/?小鼠的肺炎模型,以γδT細(xì)胞為研究對象,初步探討了在金黃色葡萄球菌的肺炎中γδT細(xì)胞對宿主機(jī)體的免疫應(yīng)答作用和機(jī)制研究。
　　方法：
　　1.S.aures/75菌株感染C57BL/6、B6TCR-δ?/?小鼠模型建立方法2.肺組織中指標(biāo)檢測
　　2.1.細(xì)菌定植總數(shù)評價
　　2.2.肺組織病理切片的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色

18、　　2.3.Real-timePCR法檢測小鼠肺組織細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)
　　2.4.流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)因子
　　結(jié)果：
　　1.在S.aures/75菌株感染小鼠肺炎中小鼠肺組織γδT細(xì)胞明顯增加,Vγ4+細(xì)胞亞型數(shù)量多于Vγ1+亞型。
　　2.TCR-δ?/?小鼠可導(dǎo)致宿主對細(xì)菌清除減弱和急性肺損傷的嚴(yán)重程度減弱。
　　3.感染S.aures/75菌株后,在TCR-δ?/?小鼠感染部位,表現(xiàn)出中性

19、粒細(xì)胞的募集被抑制及細(xì)胞因子產(chǎn)生減少的現(xiàn)象。
　　4.S.aures/75菌株感染可早期誘導(dǎo)WT小鼠在肺組織局部引起γδT細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng),產(chǎn)細(xì)胞因子IL-17。但在TCR-δ?/?小鼠感染組中,γδT細(xì)胞的缺失導(dǎo)致IL-17的產(chǎn)生的缺失。
　　5.γδT細(xì)胞的缺失導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1.在S.aures/75菌株感染的肺組織中,γδT細(xì)胞的增加有助于宿主體內(nèi)細(xì)菌的清除和肺組織炎癥損傷。