基于可重復(fù)使用免疫磁珠的抗體檢測方法建立及可重復(fù)使用磁性微流體蛋白芯片初步設(shè)計(jì).pdf

1、抗體檢測可用于評價(jià)人和動(dòng)物免疫功能的指標(biāo)，對于有關(guān)疾病的診斷具有重要意義。本課題基于可重復(fù)使用的免疫磁珠技術(shù)，抗原表位分析預(yù)測技術(shù)，多肽合成及篩選技術(shù)，建立了一種簡捷快速高效的特異抗體檢測方法。 首先應(yīng)用Garnier-Robson方案，Chou-Fasman方案和Karplus-Schulz方案分析人類巨細(xì)胞病毒(Humancytomegaloviruses，HCMV)pp150蛋白二級結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域和可塑性區(qū)域，再按Kyt

2、e-Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測其親水性；按Emini方案預(yù)測蛋白質(zhì)的表面可能性；按Jameson-Wolf方案預(yù)測抗原表位可能性。最后根據(jù)Kolaskar-Tongaonkar的方法進(jìn)行抗原表位預(yù)測。根據(jù)以上預(yù)測結(jié)果，我們設(shè)計(jì)了7條pp150的抗原表位序列。 用Fmoc固相合成策略將設(shè)計(jì)的7條pp150抗原表位序列分別合成線性肽和8分枝多聚抗原肽。純化后采用激光解析質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明合成多肽質(zhì)譜測定的分子量與預(yù)期

3、相符。 分別稱取適量各線性肽及多聚肽，用包被緩沖液分別稀釋至2μg/L包被ELISA微孔板，每孔100μl，4℃過夜，用ELISA法檢測20倍稀釋的質(zhì)控血清，結(jié)果單純線性肽檢測結(jié)果普遍偏低，對質(zhì)控血清無分辨效果，而用八分枝多聚抗原肽[pp150-8MAPs(1～7)]檢測15份陽性及10份陰性質(zhì)控血清，檢測結(jié)果均良好，其中弱陽性血清450nmOD值均大于陰性血清450nmOD值的2.1倍，表示該pp150-8MAPs(1～7)對

4、質(zhì)控血清具有較好的分辨率。 采用加福氏佐劑的方法用線性肽與多聚肽分別免疫Balb/c小鼠，收集免疫后小鼠抗血清，將pp150的重組蛋白抗原以1μg/ml的濃度溶于包被緩沖液中，分別以100μl/孔加于酶標(biāo)板中，4℃包被過夜。用ELISA法檢測免疫后抗血清滴度。結(jié)果用線性肽免疫的小鼠其血清中未檢到相應(yīng)的抗體，用八分枝多聚肽免疫的小鼠，血清抗體滴度平均為1∶3200，其中最高為pp150-8MAPs4和pp150-8MAPs5，分別

5、達(dá)到1∶12800和1∶6400。 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇免疫原性及抗原性最強(qiáng)的PP150-8MAPs4分枝肽采用加福氏佐劑的方法免疫新西蘭兔制備標(biāo)準(zhǔn)抗血清，結(jié)果得到的標(biāo)準(zhǔn)抗血清滴度達(dá)到1∶12800。 將pp150-8MAPs4以共價(jià)結(jié)合形式包被于DynabeadsM-450Tosylactivated磁珠表面，制備特異性免疫磁珠。優(yōu)化包被條件，選擇最佳包被濃度。應(yīng)用該免疫磁珠檢測標(biāo)準(zhǔn)抗血清中的抗體，優(yōu)化檢測條件。在抗

6、體檢測反應(yīng)結(jié)束后，洗脫抗體-二抗復(fù)合物，再生后的免疫磁珠重復(fù)用于標(biāo)準(zhǔn)抗血清樣品的檢測分析，并分析免疫磁珠可重復(fù)利用的次數(shù)。結(jié)果pp150-8MAPs4的最佳包被量為100μg/mL，此時(shí)包被效率為79％。用免疫磁珠法檢測兔標(biāo)準(zhǔn)抗血清，免疫磁珠可重復(fù)進(jìn)行20次以上的檢測分析。 本課題最終擬建立可重復(fù)使用磁性微流體蛋白芯片，該芯片建成后將實(shí)現(xiàn)對已知抗體的快速，自動(dòng)化，大規(guī)模檢測，同時(shí)對已知抗體檢測的靈敏度，特異性，可靠性均達(dá)到或高于