TGFβ3通過調(diào)控ΔNp63的表達(dá)影響腭部發(fā)育過程中腭周皮細(xì)胞脫落的作用研究.pdf

1、目的：唇腭裂是口腔頜面部最常見的先天性發(fā)育缺陷，從遺傳學(xué)角度可以將其分為:非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂[non-syndromic cleft lip with or withoutcleft palate(NSCL/P)]、非綜合征性單純腭裂[non-syndromic cleft palateonly(NSCPO)]、綜合征性唇裂伴或不伴腭裂[syndromic cleft lip with orwithout cleft palat

2、e(CL/P)]以及綜合征性單純腭裂[syndromic cleftpalate only(CPO)]。其中，非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂(NSCL/P)和非綜合征性單純腭裂(NSCPO)是一類不伴發(fā)其他系統(tǒng)或器官畸形的疾病，是不在綜合征之內(nèi)的單純唇裂、唇裂合并腭裂、或單純腭裂的總稱，此類唇腭裂是由復(fù)雜的遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的多基因、多因素遺傳性疾病。
　　假設(shè)TGFβ3通過調(diào)節(jié)IRF6和△Np63的表達(dá)水平而影響腭周皮

3、細(xì)胞的形成和脫落，從而參與腭部發(fā)育過程的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)中分別對TGFβ3基因敲除型、△Np63基因敲除型和野生型(wild-type，WT)小鼠胚胎（胎鼠）的頭顱冠狀切片及由野生型小鼠取材并行原代培養(yǎng)得到的MEE細(xì)胞，進(jìn)行了生化分析、基因活性分析和蛋白表達(dá)分析等相關(guān)的研究，以驗(yàn)證該假設(shè)成立與否，進(jìn)而揭示TGFβ3、IRF6和△Np63在腭部發(fā)育過程中調(diào)控腭周皮細(xì)胞形成和脫落的具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.對胚胎第14.5天

4、[dpc(days post coitum)]的TGFβ3基因敲除型，△Np63基因敲除型及野生型小鼠頭顱冠狀石蠟切片進(jìn)行H&E染色，以從形態(tài)學(xué)分析此時期各型胎鼠的腭板結(jié)構(gòu)及細(xì)胞組成。
　　2.應(yīng)用掃描電子顯微鏡(SEM)對胚胎第14.25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面進(jìn)行掃描，以從微觀上觀察腭板表面上皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　3.應(yīng)用原子力顯微鏡(AFM)結(jié)合針尖增強(qiáng)拉曼(TERS)光譜術(shù)，對胚胎第14.

5、25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面進(jìn)行掃描，以納米級分辨率獲得腭板表面形貌結(jié)構(gòu)信息及表面粗糙度信息。
　　4.對腭部發(fā)育不同時期的TGFβ3基因敲除型，△Np63基因敲除型及野生型小鼠頭顱冠狀石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光雙重染色，以從蛋白水平確定腭部發(fā)育過程中，腭板間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　5.采用原代培養(yǎng)的野生型小鼠腭中線上皮細(xì)胞(MEE)，研究TGFβ基因?qū)Α鱊p63和IRF

6、6表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。用不同劑量(0.5，1.0，3.0，5.0和10.0ng/ml)的外源性重組人類TGFβ3(rTGFβ3)處理腭中線上皮細(xì)胞，并于不同時間點(diǎn)（12小時，24小時，36小時和48小時）分別提取蛋白質(zhì)和mRNA，并分別采用Westernβlot技術(shù)檢測△Np63和IRF6蛋白的表達(dá)變化，采用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測△Np63和IRF6 mRNA的水平變化。
　　6.以pGL3作為載體，構(gòu)建小鼠重組△

7、Np63螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MEE細(xì)胞后，采用外源性重組人類TGFβ3(rTGFβ3)處理細(xì)胞，通過重組質(zhì)粒螢光素酶活性分析，檢測△Np63啟動子活性。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠頭顱冠狀石蠟切片的H&E染色，掃描電子顯微鏡(SEM)分析及原子力顯微鏡(AFM)分析結(jié)果，均顯示腭板抬起至水平向以后，隨著腭板的生長，至二者相互接觸前，野生型(WT)胎鼠腭板表面的腭周皮細(xì)胞逐漸發(fā)生皺縮、突起、變圓等改變，直至后期自腭

8、板表面脫落，因此其腭板表面較粗糙，且兩腭板接觸后形成腭中縫上皮帶;而TGFβ3基因敲除（-/-）型胎鼠的腭周皮細(xì)胞始終存留于腭板表面，腭板表面光滑，表層細(xì)胞健康，且在兩腭板接觸后，接觸區(qū)的雙層腭板上皮細(xì)胞之間尚嵌有一層扁平狀的腭周皮細(xì)胞，因此兩腭板接觸不緊密。
　　2.小鼠頭顱冠狀石蠟切片的免疫組化染色及免疫熒光染色結(jié)果顯示:a.腭部發(fā)育后期，野生型胎鼠腭板上皮細(xì)胞表面尚有一層不連續(xù)的扁平狀細(xì)胞，且有凋亡小體檢出;而TGFβ3基因

9、敲除型胎鼠腭板表面的扁平狀細(xì)胞排列緊密，且無細(xì)胞凋亡狀況。
　　b.腭部發(fā)育過程中，腭板最表層的單層扁平狀細(xì)胞確為腭周皮細(xì)胞，因其表達(dá)腭周皮細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白。
　　c.在兩腭板水平生長至即將接觸之前，野生型胎鼠腭板接觸融合區(qū)的腭板上皮細(xì)胞核內(nèi)△Np63的表達(dá)明顯降低，而TGFβ3基因敲除型胎鼠的腭中線上皮細(xì)胞內(nèi)△Np63呈現(xiàn)持續(xù)的高表達(dá)，提示腭板發(fā)育后期TGFβ3可能通過下調(diào)△Np63的表達(dá)水平，從而促進(jìn)腭周皮細(xì)胞脫落。<

10、br>　　d.腭部發(fā)育早期，△Np63基因敲除型胎鼠的腭板表面腭周皮細(xì)胞缺如，但是在腭板抬起至水平向以后，腭板的鼻腔側(cè)迅速與鼻中隔區(qū)域發(fā)生融合;而腭板的口腔側(cè)上皮出現(xiàn)少量腭周皮細(xì)胞。
　　e.IRF6在腭板內(nèi)的分布與表達(dá)情況，均不受TGFβ3或者△Np63基因敲除與否的影響。
　　3.Western Blot及實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，采用外源性TGFβ3對原代培養(yǎng)的MEE細(xì)胞進(jìn)行處理，可明顯降低△Np63的表達(dá)水平，但I(xiàn)

11、RF6的表達(dá)未受影響。
　　4.螢光素酶活性分析結(jié)果顯示，TGFβ3處理被轉(zhuǎn)染的MEE細(xì)胞，可明顯降低△Np63的啟動子活性。
　　結(jié)論：
　　1.兩腭板水平生長至互相接觸前，WT胎鼠腭板表面的腭周皮細(xì)胞脫落，兩腭板互相融合，形成完整的腭部結(jié)構(gòu);而TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮細(xì)胞仍然存留，阻礙了腭板的融合，引發(fā)腭裂;
　　2.TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮細(xì)胞之所以存留，與IRF6和△Np63的持續(xù)高表達(dá)有關(guān);腭周

12、皮細(xì)胞的凋亡和脫落依賴于TGFβ3對△Np63的功能性抑制作用，與IRF6的表達(dá)無關(guān);
　　3.△Np63 KO胎鼠發(fā)生腭裂與TGFβ3 KO胎鼠源于完全不同的機(jī)制，前者是由于腭板抬起后與鼻中隔結(jié)構(gòu)發(fā)生過早的融合，阻礙了腭板的水平生長和接觸而引起腭裂;
　　4.腭部發(fā)育過程中，TGFβ3對△Np63發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用:腭部發(fā)育初期，IRF6的轉(zhuǎn)錄激活（可能由Wnt/TGFβ1/Ephrin/Notch/Jag2等介導(dǎo)）可有效