基于馬赫澤德結(jié)構(gòu)的差分干涉SPR傳感系統(tǒng)與生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用研究.pdf

1、表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)傳感器是一種用于探測(cè)傳感芯片表面折射率變化的傳感器，它主要適用于對(duì)大分子結(jié)合反應(yīng)的實(shí)時(shí)測(cè)量，自從上世紀(jì)80年代開(kāi)始，SPR傳感器已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并有一系列商用傳感器面世。SPR傳感器最重要的性能指標(biāo)是分辨率和動(dòng)態(tài)范圍，在SPR的四種檢測(cè)方式（強(qiáng)度、角度、波長(zhǎng)、相位）之中，相位檢測(cè)方法具有最高的靈敏度，但由于其光路復(fù)雜、易受環(huán)境噪聲影響以及動(dòng)態(tài)范圍較

2、窄，限制了它的使用。本研究搭建的基于馬赫澤德結(jié)構(gòu)的差分干涉型SPR傳感系統(tǒng)是一種新型的相位調(diào)制型SPR系統(tǒng)，它在擁有高靈敏度優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，可大幅降低環(huán)境噪聲，從而達(dá)到很高的分辨率，并且由于該系統(tǒng)從時(shí)間軸提取相位信息，在進(jìn)行SPR成像傳感時(shí)不損失空間分辨率，與傳統(tǒng)的相位調(diào)制型SPR成像技術(shù)相比具有很大優(yōu)勢(shì)。
　　本文首先介紹了SPR技術(shù)的基本理論，并在該理論基礎(chǔ)上分析了影響相位調(diào)制型SPR傳感器靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍的四大因素:金屬介電常數(shù)

3、、入射光波長(zhǎng)、金膜厚度和入射角度，其中金膜厚度是一個(gè)易于調(diào)節(jié)的因素，可以在動(dòng)態(tài)范圍滿足測(cè)量要求的基礎(chǔ)上盡可能提高靈敏度，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　搭建了基于馬赫澤德結(jié)構(gòu)的差分干涉型SPR傳感器，介紹了本系統(tǒng)提取相位信息的方法和差分干涉降低噪聲的原理，編寫了相位提取程序，在程序中使用非線性擬合及取平均的方法降低了系統(tǒng)噪聲。制作了微流控系統(tǒng)，使用輪廓儀測(cè)量高真空鍍膜機(jī)蒸鍍所得金膜的厚度，從而選取厚度為45nm左右的金膜進(jìn)行傳感芯片的制作

4、，將使用模塑法制作的PDMS基片和傳感芯片進(jìn)行氧離子鍵合以制成微流槽。通過(guò)精確調(diào)節(jié)入射角，盡可能減小入射角與SPR角的誤差以發(fā)揮相位調(diào)制SPR傳感器高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，確定系統(tǒng)達(dá)到最高分辨率所需測(cè)量次數(shù)為15次，通過(guò)測(cè)量一系列折射率的NaCl溶液，確定了系統(tǒng)的分辨率為10-5折射率單位。
　　進(jìn)行了基于馬赫澤德結(jié)構(gòu)的差分干涉SPR成像傳感器的研究工作，雖然差分干涉SPR傳感器提取相位的方式不損失空間分辨率，但該方法需要將p光和s光兩幅

5、干涉圖進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)后提取相位，本研究使用光闌增加參考光圖樣的相似性，并進(jìn)行互相關(guān)運(yùn)算來(lái)優(yōu)化對(duì)準(zhǔn)效果。由于硬件性能的限制，系統(tǒng)中使用CCD采集圖像數(shù)據(jù)的頻率為30幀/s，在程序中采取局部多項(xiàng)式最小二乘曲線擬合法盡量減小由采集頻率較低造成的誤差。調(diào)節(jié)壓電陶瓷的移動(dòng)速度至0.6μm/s，以彌補(bǔ)較低采集頻率帶來(lái)的誤差，程序計(jì)算所得相變值的誤差為±0.65°，通過(guò)測(cè)量一系列折射率的NaCl溶液，確定了系統(tǒng)的分辨率為10-4折射率單位，系統(tǒng)的空間分辨率

6、為9.77μ m×15.63μ m。
　　將本系統(tǒng)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)的研究工作包括:傳感芯片表面的活化、實(shí)時(shí)檢測(cè)牛血清白蛋白與抗體的結(jié)合反應(yīng)、檢測(cè)低濃度乙肝表面抗原溶液、實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系與表皮生長(zhǎng)因子的反應(yīng)。本系統(tǒng)使用以硫醇體系為基礎(chǔ)的自組裝膜技術(shù)活化傳感芯片，可以使生物分子定向結(jié)合在芯片表面。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)檢測(cè)牛血清白蛋白與特異性抗體的結(jié)合反應(yīng)，在整個(gè)測(cè)量過(guò)程中，一共增加了2.5×10-3折射率單位，對(duì)應(yīng)IgG

7、免疫球蛋白結(jié)合密度為160個(gè)/μm2。從血清中檢測(cè)乙肝表面抗原是否存在是判斷乙肝感染的指標(biāo)，因此使用高靈敏度的檢測(cè)手段，進(jìn)行準(zhǔn)確的定性測(cè)量是具有重要意義的，使用本系統(tǒng)能夠在30分鐘之內(nèi)測(cè)量出1-10ng/ml濃度的乙肝表面抗原，在檢測(cè)分辨率上相當(dāng)于目前常用的ELISA和RIA檢測(cè)方法，而檢測(cè)時(shí)間則短于上述兩種方法。對(duì)三種具有不同表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞系與表皮生長(zhǎng)因子的結(jié)合過(guò)程以及接下來(lái)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)檢測(cè)，結(jié)果表明