含硫氨基酸殘基翻譯后修飾在突觸可塑性和神經(jīng)細胞氧化性損傷中的作用及機制.pdf

1、第一部分半胱氨酸殘基氧化-還原修飾對海馬CA1區(qū)突觸可塑性的調(diào)節(jié)及機制
　　目的:半胱氨酸殘基的氧化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基通過不同程度的氧化形成多種修飾形式,如-S-S-;-S-OH;-SO3;-SSG等,這種修飾與蛋白質(zhì)磷酸化修飾一樣,是兩種進化上高度保守的蛋白翻譯后修飾之一,改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及活性。目前關(guān)于半胱氨酸殘基的氧化修飾在突觸生物學中的作用尚未闡明。本課題通過選擇性地還原蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基

2、的氧化狀態(tài),研究其對衰老大鼠海馬CA1區(qū)突觸傳遞長時程增強(LTP)損傷的調(diào)節(jié)作用,并探討其對LTP形成的兩個關(guān)鍵因素:NMDA受體激活和AMPA受體上膜的影響。
　　方法:急性分離大鼠海馬腦片,電生理記錄,Western blotting技術(shù),BS3交聯(lián)法分析膜蛋白,膜蛋白提取。
　　結(jié)果:選擇性巰基氧化劑DTNB抑制青年大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體功能及NMDA受體介導的LTP;反之巰基還原劑DTT可增強該反應。巰基還原

3、劑DTT、β-ME、還原型谷胱甘肽恢復衰老大鼠海馬 CA1區(qū) NMDA受體功能及NMDA受體介導的LTP;但抗氧化劑維生素C和維生素E無此作用。DTT能逆轉(zhuǎn)過氧化氫引起的LTP損傷,而抗氧化劑只能預防過氧化氫引起的LTP損傷。DTT、β-ME增強海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的AMPA受體上膜并增加AMPA受體電流,該作用與其減少PICK1介導的AMPA受體內(nèi)吞有關(guān)。巰基還原劑DTT、β-ME能抑制低頻刺激誘發(fā)的海馬CA1區(qū)突觸傳遞長時程抑制(LT

4、D)。氧化應激改變AMPA受體巰基還原狀態(tài),引起海馬CA1區(qū)AMPA受體下膜。
　　結(jié)論:半胱氨酸殘基的氧化修飾影響海馬CA1區(qū)NMDA受體功能和AMPA受體膜轉(zhuǎn)運,從而損傷青年和老年鼠的海馬突觸可塑性。巰基還原劑則可增加NMDA受體功能和AMPA受體膜轉(zhuǎn)運,減輕衰老引起的可塑性損傷。
　　第二部分半胱氨酸殘基硫巰基化修飾對海馬CA1區(qū)突觸可塑性的調(diào)節(jié)及機制
　　目的:研究發(fā)現(xiàn),半胱氨酸殘基不僅可發(fā)生形式多樣的氧化修飾

5、,還能發(fā)生一種可增強其還原狀態(tài)的翻譯后修飾——硫巰基化修飾(S-sulfhydration,-SSH)。這種修飾主要由硫化氫氣體信號分子介導。近年來發(fā)現(xiàn)硫化氫和神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。最新研究表明,硫化氫通過硫巰基化修飾半胱氨酸殘基,調(diào)節(jié)靶蛋白的結(jié)構(gòu)和活性。目前,關(guān)于硫巰基化修飾在突觸可塑性中的作用鮮有報道。這種硫巰基化修飾可被預先給予DTT所阻斷。本課題旨在研究半胱氨酸殘基硫巰基化對突觸可塑性中兩個關(guān)鍵因素:NMDA受體激活和AMPA

6、受體上膜的調(diào)控作用,以及對衰老大鼠海馬CA1區(qū)LTP損傷的作用,并初步探討其分子機制。
　　方法:急性分離大鼠海馬腦片、電生理記錄、Western blotting技術(shù)、BS3交聯(lián)法分析膜蛋白和硫巰基化蛋白分析。
　　結(jié)果:硫化氫介導的半胱氨酸殘基硫巰基化增強海馬CA1區(qū)NMDA受體功能和AMPA受體上膜,該作用與硫化氫激活突觸后LTP相關(guān)多條信號通路有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性硫化氫信號對θ節(jié)律串刺激(theta burs

7、t stimulation,TBS)LTP的誘發(fā)必不可少。使用硫氫化鈉孵育腦片補充減少的硫化氫信號,可增加衰老鼠海馬CA1區(qū)硫巰基化蛋白數(shù)目,部分恢復衰老鼠CA1區(qū)神經(jīng)元受損的NMDA受體功能,并激活LTP相關(guān)多條信號通路,從而修復衰老引起的海馬CA1區(qū)LTP損傷。
　　結(jié)論:半胱氨酸殘基的硫巰基化修飾增強海馬CA1區(qū)NMDA受體功能和AMPA受體膜表達,易化青年鼠海馬CA1區(qū)的LTP誘發(fā),并部分減弱衰老引起的LTP損傷。

8、　　第三部分蛋氨酸殘基氧化還原修飾對神經(jīng)細胞氧化應激損傷的保護作用及機制
　　目的:蛋白質(zhì)蛋氨酸殘基的硫甲基結(jié)構(gòu)在一定條件下和活性氧結(jié)合形成亞砜,隨后在蛋氨酸亞砜還原酶A(MsrA)的作用下還原成蛋氨酸,這一蛋氨酸氧化-還原循環(huán)在體內(nèi)氧自由基清除、蛋白質(zhì)功能維持等過程中發(fā)揮重要作用。目前認為,這一過程主要依賴于硫甲基的抗氧化特性,MsrA只起到維持還原態(tài)蛋氨酸濃度的作用。但該理論不能解釋很多實驗現(xiàn)象,如:體外發(fā)生蛋氨酸氧化需要很高

9、濃度的氧化劑;衰老過程中各種組織氧化應激損傷加重,MsrA表達明顯下降,但總的氧化型蛋氨酸比例卻未出現(xiàn)相應升高等。我們推測:體內(nèi)蛋氨酸和活性氧的反應需要MsrA催化,是一種酶促的活性氧清除反應。因此本研究進一步探討MsrA參與蛋氨酸氧化-還原循環(huán),發(fā)揮抗氧化應激損傷的作用機制,并初步研究兩種新發(fā)現(xiàn)的MsrA調(diào)節(jié)劑的神經(jīng)細胞保護作用。
　　方法:細胞培養(yǎng),MTT染色,臺盼藍染色,PI染色,LC-MS,Western blotting

10、,生化檢測,基因重組蛋白表達等。
　　結(jié)果:體外魯米諾反應發(fā)現(xiàn),加入有活性的MsrA會明顯易化L型蛋氨酸(L-Met)和體外活性氧的反應,并加速DTT和過氧化氫的體外反應。細胞實驗發(fā)現(xiàn),較低濃度的L-Met(1-5 mM)介導的抗氧化應激作用可被MsrA抑制劑DMSO所取消。進一步研究發(fā)現(xiàn),低濃度白藜蘆醇(RSV)增加SH-SY5Y細胞MsrA的表達和功能,從而減輕氧化應激和神經(jīng)毒素所致的SH-SY5Y細胞損傷。小分子二甲基硫醚(