顳下頜關(guān)節(jié)源性疼痛模型的建立及TNF-α和NF-κB的表達(dá)及意義.pdf

1、本研究通過(guò)建立顳下頜關(guān)節(jié)(TemporomandibularJoint，TMJ)源性關(guān)節(jié)痛模型，探討NF-κB、TNF-α在TMJ源性關(guān)節(jié)痛中的組織分布及表達(dá)水平的變化，為明確TMJ源性關(guān)節(jié)痛機(jī)制提供初步研究依據(jù)。 研究目的： 1.建立顳下頜關(guān)節(jié)源性關(guān)節(jié)痛模型。 2.探討NF-κB、TNF-α在TMJ源性關(guān)節(jié)痛中表達(dá)及意義。 研究材料與方法： 1.建立TMJ源性關(guān)節(jié)痛動(dòng)物模型。 SD大鼠隨

2、機(jī)抽取50只作為實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)TMJ注入CFA(結(jié)核桿菌與油劑按1：1配制)50μL。分為實(shí)驗(yàn)1組(5只不處死)，觀察TMJ源性關(guān)節(jié)痛自然過(guò)程；實(shí)驗(yàn)2組(20只)不同時(shí)點(diǎn)處死，觀察炎癥程度的改變；實(shí)驗(yàn)3組(20只)不同時(shí)點(diǎn)處死，觀察病理改變和fos蛋白的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)4組(5只)觀察機(jī)械異常性疼痛閾值。15只作為陰性對(duì)照組，左側(cè)TMJ注入生理鹽水50μL，陰性對(duì)照1組(5只)觀察炎癥程度的改變；陰性對(duì)照2組(5只)觀察病理改變和fos蛋白的表

3、達(dá)；陰性對(duì)照3組(5只)觀察機(jī)械異常性疼痛閾值。5只作為空白對(duì)照組不做任何處理。每天觀察動(dòng)物的行為改變、體重變化、注射側(cè)關(guān)節(jié)區(qū)水腫及血淚癥。分別于2h、1天、3天、10天處死動(dòng)物。其中實(shí)驗(yàn)3組，陰性對(duì)照2組及空白對(duì)照組進(jìn)行心臟灌注，收集TMJ組織標(biāo)本進(jìn)行病理分析，腦干及頸髓固定后在-20℃冰凍切片，免疫組化檢測(cè)fos蛋白。實(shí)驗(yàn)2組、陰性對(duì)照1組、空白對(duì)照組也于同樣時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物，處死動(dòng)物前10分鐘通過(guò)尾靜脈注入伊文氏藍(lán)，取關(guān)節(jié)組織標(biāo)本，確

4、定外滲范圍并測(cè)定伊文氏藍(lán)外滲濃度。 不同時(shí)點(diǎn)把vonfrey纖絲放在實(shí)驗(yàn)4組、陰性對(duì)照3組雙側(cè)TMJ表面皮膚，檢測(cè)引起反應(yīng)的克數(shù)。纖絲逐漸遞增直到大鼠有后縮反應(yīng)。每個(gè)纖絲每次測(cè)試均以1.5秒的時(shí)間均勻施壓直到完全彎曲為止。重復(fù)5次，每次間隔5秒，能夠在五個(gè)大鼠的測(cè)試中產(chǎn)生三個(gè)后縮反應(yīng)的最小克數(shù)被認(rèn)為是該時(shí)點(diǎn)的機(jī)械異常性疼痛閾值。 2.免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)TMJ源性關(guān)節(jié)痛動(dòng)物模型20

5、只，2h、1d、3d、10d處死動(dòng)物，收集的TMJ組織標(biāo)本固定、包埋、切片，進(jìn)行IHC染色，檢測(cè)TNF-α、NF-κB表達(dá)，光鏡下觀察。 3.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。 TMJ源性關(guān)節(jié)痛動(dòng)物模型20只，同樣時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物，收集關(guān)節(jié)標(biāo)本，冰浴下勻漿、提取總蛋白、測(cè)定蛋白含量，ELISA檢測(cè)TNF-α濃度，計(jì)算細(xì)胞因子相當(dāng)含量=細(xì)胞因子(pg/mL)/總蛋白(mg/mL)。 研究結(jié)果： 1.TMJ源性關(guān)節(jié)痛動(dòng)物模型的確

6、立。 實(shí)驗(yàn)組1d、3d、10d注射側(cè)TMJ均出現(xiàn)水腫和血淚癥，組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1天部分滑膜增生2～3層，3天滑膜明顯增生，10天滑膜增生成茸毛狀。TMJ后區(qū)水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維素性滲出。髁狀突無(wú)骨質(zhì)破壞。 2h、1d、3d伊文氏藍(lán)外滲濃度、fos蛋白表達(dá)水平逐漸升高與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)：第10天下降，但fos蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，伊文氏藍(lán)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

7、.05)。實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組體重在注射后7天均出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象，行為無(wú)明顯變化。 實(shí)驗(yàn)組注射側(cè)2h可觀察到疼痛閾值降低，1d達(dá)到最低值，隨后逐漸上升，持續(xù)2周。與實(shí)驗(yàn)組對(duì)側(cè)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.IHC細(xì)胞因子分布特點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)組TNF-α2h、1天、3天在外滲炎癥細(xì)胞、滑膜下層纖維原細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。第10天滑膜細(xì)胞、滑膜下層纖維原細(xì)胞表達(dá)陰性，血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性。

8、陰性對(duì)照組TNF-α反應(yīng)陰性。實(shí)驗(yàn)組NF-κB2h、1天、3天在滑膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞核表達(dá)，且核內(nèi)表達(dá)逐漸升高，陰性對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)有少量表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第10天NF-κB陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3.細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)水平的檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)組2h、1天、3天TNF-α表達(dá)水平逐漸升高，第三天達(dá)到最大值，第10天下降下降，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

9、 4.NF-κB與TNF-α、NF-κB與fos蛋白的相關(guān)性分析NF-κB與TNF-α表達(dá)負(fù)相關(guān)(P=0.036，R=-0.496)；NF-κB與fos蛋白表達(dá)顯著相關(guān)(P=0.002，R=0.6782)。 研究結(jié)論： 1.CFA作為一種致痛物質(zhì)，可以引起TMJ慢性疼痛，且局限、固定、較輕，穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，可以基本模擬臨床上TMJ源性關(guān)節(jié)疼痛，提示可以作為一個(gè)比較理想的TMJ慢性疼痛模型。 2.TMJ