肽核酸鉗制定量PCR法檢測K-ras基因突變的胰腺癌診斷應用.pdf

1、胰腺癌是目前預后最差的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。胰腺癌早期癥狀不典型，缺乏簡單、方便的檢查手段，特別是缺乏特異性腫瘤標記物，是造成胰腺癌早期診斷困難的重要原因。隨著腫瘤分子生物學研究的不斷深入，基因診斷有望給胰腺癌的早期診斷帶來突破。近年來研究從胰腺穿刺活檢組織、胰液、十二指腸液和糞便等標本中檢測到頻繁的K-ras基因突變，為胰腺癌的早期診斷提供了可能。但基因突變檢測方法限于傳統(tǒng)的基因表達、序列測定、突變和多態(tài)性分析等，只

2、適用于少數(shù)樣品的測定，操作步驟多且費力，不便于自動化。因此，本研究設計采用肽核酸(PNA)鉗制PCR實時定量技術檢測胰腺癌K-ras基因點突變，旨在探討K-ras、基因突變檢測對胰腺癌早期診斷的價值，建立適合臨床應用的高效、簡便、快捷的胰腺癌診斷方法。 我們設計并合成了針對K-ras基因第12、13密碼子的肽核酸，在實時定量檢測中，肽核酸對野生型基因具有抑制作用。通過反復實驗，建立該方法并進行條件優(yōu)化，包括DNA模板需要量、PN

3、A加入量及反應時間、反應條件等。并通過測序方法驗證了該方法的準確性。同時，使用優(yōu)化后的方法對122例臨床血液標本DNA進行檢測。其中67例胰腺癌標本中，突變率為59.7％(34/67)；慢性胰腺炎共22例，突變率為13.6％(3/22)；33例健康志愿者標本無一例突變。實驗結果證明，該方法簡便，可同時檢測數(shù)十個樣本；敏感性高，可檢出的最小模板量為10<'3>拷貝，可檢出的突變/野生比例在10<'3>/10<'8>以上。該方法適用于輔助臨