大菱鲆性別決定機(jī)制與染色體組工程育種技術(shù)的研究.pdf

1、大菱鲆（Scophthalmusmaximus）是世界性鲆鰈類養(yǎng)殖良種，養(yǎng)殖范圍遍及歐、美、亞洲十幾個沿海國家。中國是大菱鲆養(yǎng)殖大國，年產(chǎn)量近6萬噸，占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80％以上，產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值超過50億元，是北方海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)，可以說，涉及大菱鲆苗種養(yǎng)殖性狀的微小提升都將對產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到級聯(lián)促進(jìn)作用。染色體組工程育種技術(shù)是魚類遺傳育種和種質(zhì)改良的重要組成部分，也是研究魚類性別遺傳決定類型的最直接和有效的方法。本研究建立了大菱鲆減數(shù)分裂型、

2、有絲分裂型雌核發(fā)育和四倍體誘導(dǎo)等染色體組操作技術(shù)，明確了大菱鲆性腺分化關(guān)鍵時期及其性別遺傳決定機(jī)制，為大菱鲆全雌和三倍體苗種產(chǎn)業(yè)化培育奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)大菱鲆減數(shù)分裂型雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)
　　采用正交設(shè)計實驗方法優(yōu)化了真鯛冷凍精子誘導(dǎo)大菱鲆減數(shù)分裂型雌核發(fā)育的誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明，真鯛精子是誘導(dǎo)大菱鲆卵子胚胎發(fā)育的理想刺激源，未經(jīng)紫外線照射處理的真鯛精子與大菱鲆卵子受精后形成的胚胎，無論是否經(jīng)過冷休克

3、處理都不能孵化出膜;精液稀釋至1/20、厚度0.4mm，經(jīng)劑量為6480～7200 erg·mm-2紫外線照射處理后的真鯛精子與大菱鲆卵子受精后形成的胚胎，初孵仔魚表現(xiàn)出典型的單倍體綜合征;受精和孵化水溫為(14.5±0.5℃)時，大菱鲆減數(shù)分裂型雌核發(fā)育單倍體的冷休克二倍體化的最佳處理起始時間、處理水溫和持續(xù)時間分別為受精后6.5 min、-2℃和45 min。至孵化后60日齡，雌核發(fā)育苗種的成活率為0.61％，僅相當(dāng)于其半同胞苗種的

4、10％左右，60-180日齡兩者成活率的差異不顯著，均達(dá)90％以上;14月齡前，雌核發(fā)育苗種的全長和體重都比半同胞普通苗種要低，至17月齡時其全長和體重與半同胞對照一致，兩者無顯著性差異。
　　(2)大菱鲆不同倍性胚胎發(fā)育時序和形態(tài)的比較研究
　　對真鯛冷凍精液誘導(dǎo)的大菱鲆單倍體、減數(shù)分裂型雌核發(fā)育二倍體和雜交二倍體，以及同源精子誘導(dǎo)的大菱鲆三倍體和普通二倍體胚胎發(fā)育時序和形態(tài)進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，在水溫14.5±0.5

5、℃孵化條件下，三倍體和雌核發(fā)育二倍體胚胎發(fā)育速度一直較普通二倍體為慢，三倍體稍快于雌核發(fā)育二倍體;單倍體在囊胚期前胚胎發(fā)育速度最快，囊胚期后發(fā)育速度逐漸變慢，原腸期發(fā)育時間最長;雜交二倍體在尾芽期前胚胎發(fā)育速度一直比普通二倍體快，心跳期胚胎發(fā)育開始停止，胚胎死亡，不能正常孵出;除雜交二倍體外的各實驗組至孵化出膜所需時間和孵化率分別為:普通二倍體109h15min和83.4±3.02％，三倍體109h30min和44.6±2.40％，雌核

6、發(fā)育二倍體112h15min和42.4±3.54％，單倍體124h40min和4.5±1.91％。各組胚胎發(fā)育形態(tài)上的差別主要表現(xiàn)為雜交二倍體胚體細(xì)長，多數(shù)器官分化不全;單倍體胚胎胚體粗短、頭突大、脊柱彎曲明顯，表現(xiàn)出典型的單倍體綜合癥;雌核發(fā)育二倍體、三倍體與普通二倍體胚胎相比，形態(tài)上沒有明顯差別，但初孵仔魚畸形率顯著增高。
　　(3)大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)
　　采用靜水壓法抑制第一次卵裂，對紫外線滅活的真鯛

7、冷凍精子誘導(dǎo)大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育的實驗條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在受精和孵化水溫為14.5±0.5℃時，靜水壓法誘導(dǎo)大菱鲆有絲分裂型雌核發(fā)育二倍體的最佳處理起始時間、處理壓力和持續(xù)時間分別為受精后85-90 min、75 MPa和6 min。同一批次受精卵有絲分裂型雌核發(fā)育孵化率顯著低于減數(shù)分裂型雌核發(fā)育，胚胎畸形率顯著高于后者。規(guī)?；T導(dǎo)的有絲分裂型雌核發(fā)育孵化率為1.34％，至40dph成活率為3.25％，40-60 dph成活

8、率為51.08％，均顯著低于同期普通二倍體，60-150dph成活率為98.95％，與普通二倍體差異不顯著;150 dph時，雌核發(fā)育二倍體體重(16.18±11.30 g)和全長(9.18±2.03 cm)均顯著低于普通二倍體(33.02±6.23 g和12.24±0.77 cm);30尾雌核發(fā)育苗種在檢測的7個微衛(wèi)星位點基因純合度為99.52％。
　　(4)大菱鲆同源四倍體的誘導(dǎo)
　　采用靜水壓法抑制第一次卵裂，對大菱鲆

9、同源四倍體誘導(dǎo)條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在受精和孵化水溫為14.5±0.5℃時，大菱鲆四倍體誘導(dǎo)的最佳起始時間和處理壓力分別為75-80 min和75 MPa。利用獲得的最佳誘導(dǎo)條件處理獲得了2批次四倍體群體，四倍體誘導(dǎo)組孵化率(16.54％和11.40％)顯著低于對照組(71.62％)，畸形率（45.79％和64.10％）則顯著高于對照組(4.54％)，60 dph前成活率（0.43％和0.16％）顯著低于對照組(18.95％)，60

10、-365 dph成活率(95.48％)則與對照組(95.43％)相當(dāng)，NORs-Ag染法、染色體核型分析和血紅細(xì)胞體積測量法分別統(tǒng)計初孵仔魚期、150 dph和365 dph苗種四倍體率分別為46.67％、5％和4.95％。
　　(5)溫度對大菱鲆性別分化的影響及其性別遺傳決定類型
　　通過組織切片觀察性腺分化情況、統(tǒng)計分析高溫誘導(dǎo)性腺分化期稚魚以及雌核發(fā)育稚魚的性別比例，研究大菱鲆性腺分化起始時期、溫度對早期性別決定的影響

11、和性別遺傳決定機(jī)制。結(jié)果表明，稚魚最小全長37.43mm(45 dph)時，形成完整卵巢腔，標(biāo)志著卵巢分化的起始;全長42.83 mm(55 dph)時，形成輸精管，標(biāo)志著精巢分化的起始。平均全長為12.30±1.45mm(20 dph)和20.05±1.24 mm(28 dph)稚魚，經(jīng)25℃高溫培育和誘導(dǎo)，雄性比例分別為73.43±3.88％、74.40±6.36％，顯著偏離1∶1的性比，高溫對初始平均全長＞30mm(40dph)的