家蠶細(xì)胞色素CYP337A1的克隆與原核表達(dá).pdf

1、細(xì)胞色P450單加氧酶系是一類(lèi)廣泛分布于生物有機(jī)體中的重要酶系，P450酶曾被稱(chēng)為多功能氧化酶(MFO)、單加氧酶(monooxygenase)、芳香烴羥化酶和藥物代謝酶等多種名稱(chēng)。它能夠代謝多種內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)，細(xì)胞色素P450酶系不僅涉及一系列內(nèi)源性物質(zhì)如保幼激素及其類(lèi)似物、蛻皮甾醇和生物信息素的代謝，也涉及對(duì)外源性物質(zhì)如殺蟲(chóng)劑、植物次生物質(zhì)和環(huán)境污染物等多種化合物的代謝，因其生物學(xué)的重要性，一直是生物學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)重要對(duì)象

2、。 為了在分子水平上研究家蠶胞色素P450基因的特性，更好地探討其與抗性相關(guān)機(jī)制，本研究就家蠶細(xì)胞色素P450基因的克隆及異源表達(dá)開(kāi)展了研究，主要研究結(jié)果如下： 1.選定克隆序列從NCBI下載果蠅(Drosophila melanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)等多種昆蟲(chóng)P450s蛋白質(zhì)序列，和西南人學(xué)家蠶基因組數(shù)據(jù)中所預(yù)測(cè)的家蠶基因蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLAST P比對(duì)，其E-valve≤l

3、e-7，得到66條含有血紅素結(jié)合標(biāo)志性位點(diǎn)(P450 Signature)F××G×××C×G的P450基因序列，選擇了主要與抗性相關(guān)的CYP3集團(tuán)(clan)中具有完全編碼框的基因(并含有P450基因特征結(jié)構(gòu)域)的1條序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)度約為1，470 bp的目的條帶。 2.采甩T-A克隆法對(duì)該基岡序列進(jìn)行了克隆測(cè)序結(jié)果表明，該基因ORF為1，470 bp，編碼489個(gè)氨基酸，Expasy網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白

4、質(zhì)分子質(zhì)量為56.60 KDa，符合一般P450s的分子量為46～60 KDa的規(guī)律，等電點(diǎn)為8.64。用Sim4程序，將該基因核酸序列與家蠶基因組序列相比較發(fā)現(xiàn)只含有1個(gè)內(nèi)含子，大小為1，903 bp，外顯子和內(nèi)含子邊界處符合GT-AG規(guī)則。在推定的氨基酸序列中包含所有昆蟲(chóng)P450基因的5個(gè)特征序列，即：P450基因標(biāo)志性的F××G×××C×G(428-437)血紅素結(jié)合位點(diǎn)的共有序列；位于螺旋C中與血紅素結(jié)合有關(guān)的保守序列W×××R

5、(116-120)；位于螺旋Ⅰ中P450氧結(jié)合部位的AG×E/DT(295-299)保守序列；位于螺旋K中參與穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)的E××R(353-356)完全保守序列；以及特征序列‘PERF’的P××F×PE/DRT(404-412)。經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其N(xiāo)端包含有一條高度疏水性的信號(hào)肽序列，22個(gè)氨基酸中含有15個(gè)疏水氨基酸。 3.和其它已測(cè)序的家蠶P450基因的同源性分析從NCBI下載已測(cè)序登陸的26個(gè)家蠶細(xì)胞色素P450基因的氨基酸

6、序列，根據(jù)MEGA 3.1程序，運(yùn)用近鄰法(NJ，neighbor joining)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，得出該基岡和以代謝異生物質(zhì)為主的CYP6和CYP9家族基因的同源關(guān)系較近，和以代謝內(nèi)源物質(zhì)為主的CYP4家族基岡的同源關(guān)系較遠(yuǎn)，而和以合成與代謝昆蟲(chóng)體內(nèi)蛻皮激素、保幼激素等為主的其他家族基因的同源關(guān)系則更遠(yuǎn)。 4.和其它家族成員的同源性分析在NCBI進(jìn)行BLASTP在線同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)美國(guó)棉鈴蟲(chóng)CYP321A1和邪惡按蚊CYP6P

7、9的同源性相對(duì)較高，分別為34％、32％，均低于40％。根據(jù)規(guī)則，被國(guó)際細(xì)胞色素P450委員會(huì)命名為新家族的第一個(gè)基岡CYP337A1(GenBank登陸號(hào)：EF415297)。下載同源性較高，且具有代表性的其它家族成員的序列，利用ClustalX 1.83進(jìn)行氨基酸相似性的聚類(lèi)分析。CYP337A1具有CYP6等家族基因擁有的血紅素保守結(jié)合區(qū)PF××G×R×C×G，但在CYP6家族基因高度保守的ETLR序列及PERF序列中均發(fā)生了一定

8、變異，它和已經(jīng)與CYP6家族基因趨異分離的CYP321A1同源性相對(duì)最高。 5.原核表達(dá) 以pET50(b)為表達(dá)載體，將CYP337A1基因的編碼區(qū)亞克隆至pET50(b)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)胞，挑取單克隆用TB培養(yǎng)基在37℃進(jìn)行培養(yǎng)并用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)該基因的蛋白質(zhì)。同時(shí)以轉(zhuǎn)化有pET50(b)空載體的同時(shí)誘導(dǎo)作為對(duì)照。經(jīng)SDS-PAGE電泳在120 KDa左右得到特異目的蛋白帶，pE

9、T50(b)表達(dá)載體中Nus．Tag標(biāo)簽是64.3 KDa，而表達(dá)產(chǎn)物的蛋白分子量在56.60 KDa左右，所以，與His的融合蛋白的分子量是120 KDa。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明該基因編碼的蛋白得到了表達(dá)。 6.表達(dá)條件優(yōu)化進(jìn)一步利用不同條件對(duì)含重組質(zhì)粒的菌液進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在溫度為32℃～37℃，IPTG濃度為0.6 mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)2 h左右，蛋白表達(dá)量最大。該實(shí)驗(yàn)為利用該基因的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行功能分析創(chuàng)造了條件。