含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒的構(gòu)建及其表達(dá)的初步研究.pdf

1、背景：HIV引起的艾滋病(AIDS)自被發(fā)現(xiàn)以來，一直嚴(yán)重威脅著人類的健康，目前無有效的預(yù)防措施，抗HIV藥價(jià)格昂貴，易引起不良反應(yīng)，療效也不盡人意。近年來，活病毒載體疫苗的研究受到了越來越多的重視，HIV-1的gp120基因一直是艾滋病疫苗研究的重點(diǎn)。缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒可誘導(dǎo)系統(tǒng)性的體液免疫、細(xì)胞免疫和腸道粘膜免疫，缺失P1區(qū)蛋白編碼序列的脊髓灰質(zhì)炎病毒突變體能自我復(fù)制，且其質(zhì)量、安全檢測手段已經(jīng)完善建立。因而應(yīng)用缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病

2、毒表達(dá)載體構(gòu)建含HIV-1gp120基因重組疫苗有很大的應(yīng)用前景，目前國內(nèi)還未見用脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體構(gòu)建HIV重組疫苗的正式報(bào)道。 目的：為有效的控制艾滋病的流行，為進(jìn)一步研究預(yù)防性或治療性的HIV疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究以pT7gp120基因?yàn)槟０?，缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒為載體，構(gòu)建含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒，并研究其表達(dá)、形態(tài)及遺傳穩(wěn)定性。 方法：1、構(gòu)建重組HIV-19p120基

3、因脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體：選擇了中國HIV-1B亞型代表毒株，以質(zhì)粒pT7gp120為模板，缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒為載體，構(gòu)建含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒，并通過PCR、酶切鑒定證實(shí)HIV-1gp120基因片段是否正確的插入到脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。2、HIV-1gp120基因的表達(dá)的檢測：1)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用G418試劑對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選，得到轉(zhuǎn)入重組脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載

4、體的細(xì)胞株Hela-gp120，通過RT-PCR檢測混合細(xì)胞系中HIV-1gp120基因的表達(dá)，鑒定是否有目的基因的插入；2)通過免疫酶法檢測混合細(xì)胞系中HIV-1gp120基因的表達(dá)，檢測到是否有目的基因的表達(dá)；3)將重組病毒感染293細(xì)胞，經(jīng)過Western blot方法檢測重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒是否能感染細(xì)胞并表達(dá)目的基因片段的蛋白產(chǎn)物。3、重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒形態(tài)觀察：通過重組痘苗病毒提供缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒

5、的衣殼蛋白，組裝重組脊髓灰質(zhì)炎病毒完整顆粒，并通過氯仿-PEG/NaCl-氯仿三步法純化重組脊髓灰質(zhì)炎病毒，電鏡下觀察重組病毒形態(tài)。4、重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒安全性及遺傳穩(wěn)定性觀察：將重組脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的293細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)傳代檢測疫苗的安全性及遺傳穩(wěn)定性。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了含HIV-1gp120基因片段重組脊髓灰質(zhì)炎病毒，且能在體外表達(dá)HIV-1gp120基因片段；2、構(gòu)建的含HIV-1gp120基