基于單壁碳納米管的生物傳感器和基因載體的研究.pdf

1、在本論文中，我們研究了基于單壁碳納米管(SWNTs)的生物傳感器和基于SWNTs的納米基因載體。一方面，作為天然的納米和分子導(dǎo)線，SWNTs具有很高的電導(dǎo)率和極好的載流性能，因而是用于化學(xué)和生物化學(xué)檢測(cè)的理想材料，當(dāng)用作電化學(xué)檢測(cè)的電極材料時(shí)，它們顯示出具有極大的增強(qiáng)電子轉(zhuǎn)移的能力。另一方面，功能化的SWNTs顯示出可以穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且沒有毒性，因而，SWNTs可以用作一些分子進(jìn)入細(xì)胞的載體，尤其可以潛在的用作DNA、siRNA和

2、疫苗傳遞在內(nèi)的臨床治療。 在基于SWNTs的生物傳感器研究中，我們首先采用了一種包括幾次超聲一離心在內(nèi)的類似于“萃取”的方法對(duì)硝酸純化過的SWNTs進(jìn)行后處理，得到了純度很高的SWNTs。這種SWNTs修飾的玻碳電極對(duì)過氧化氫的檢測(cè)顯示了極好的還原電流響應(yīng)，其線性電流響應(yīng)在1.99×10-5～1.12×10-2M濃度范圍內(nèi)為12.2μA/mM(r=0.999)，是裸玻碳電極電流響應(yīng)(0.08μA/mM)的150倍。然后，我們將葡

3、萄糖氧化酶(GOx)利用其表面的氨基和SWNTs上的羧基通過共價(jià)鍵連接到一起，并用其制備了葡萄糖傳感器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SWNTs進(jìn)行化學(xué)鍵鍵接后，GOx仍保持了其活性，對(duì)葡萄糖檢測(cè)的線性電流響應(yīng)在9.6×10-4～1.296×10-2M濃度范圍內(nèi)為1.5μA/mM(r=0.995)，這種共價(jià)鍵連接的方式比物理吸附的方法具有更好的電子傳遞效果和更高的檢測(cè)靈敏度。 然后我們又通過非共價(jià)鍵吸附的方法制備了二茂鐵和SWNTs的復(fù)合物，

4、發(fā)現(xiàn)它具有很好的穩(wěn)定性，并大大增強(qiáng)了對(duì)過氧化氫檢測(cè)的靈敏度，通過電化學(xué)檢測(cè)、水解作用和其它光譜等證明顯示，二茂鐵與SWNTs是通過強(qiáng)烈的π-πstacking相互作用連接起來的，這種π-π共軛在增強(qiáng)電化學(xué)催化性能中扮演了重要角色，這種復(fù)合物對(duì)過氧化氫的檢測(cè)顯示了極低的電流響應(yīng)電位，提供了一種方便且穩(wěn)定的電極材料，可用于檢測(cè)有過氧化氫產(chǎn)生的許多生物化學(xué)反應(yīng)。結(jié)合該復(fù)合物的特點(diǎn)，我們進(jìn)一步建立了基因檢測(cè)體系，該基因檢測(cè)體系利用SWNTs-F

5、c對(duì)過氧化氫檢測(cè)的放大作用，先將一條DNA探針序列固定在金電極上，再將第二條DNA探針序列連接到SWNTs-Fc復(fù)合物上，通過與目標(biāo)DNA的雜交反應(yīng)，將SWNTs-Fc連接到金電極上，通過檢測(cè)過氧化氫得到電流響應(yīng)。這種三明治式的雜交體系，減少了對(duì)目標(biāo)DNA的處理和功能化，方便而高效的檢測(cè)出互補(bǔ)DNA序列，這里SWNTs進(jìn)行了雙功能化，既起到固定探針DNA分子和電活性分子的作用，又起到增強(qiáng)電子轉(zhuǎn)移擴(kuò)大信號(hào)的作用。 由于使用SWNT

6、s做成各種納米器件的一個(gè)關(guān)鍵問題是按照預(yù)定的模式將SWNTs組裝起來，因而在這一部分研究的最后我們利用互補(bǔ)DNA序列的特異性相互作用將DNA功能化的SWNTs組裝成枝狀結(jié)構(gòu)，原子力顯微鏡圖像顯示這種枝狀結(jié)構(gòu)的形成是基于互補(bǔ)DNA序列的堿基特殊的配對(duì)作用。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明自組裝后SWNTs的平均長(zhǎng)度是單股DNA功能化的SWNTs的七倍。這種基于DNA雜交的SWNTs自組裝為制備用于各種電子器件和分子檢測(cè)所需的納米多功能結(jié)構(gòu)提供了潛在的方法

7、。 在基于SWNTs的基因載體研究中，我們研究了功能化的SWNTs做為基因進(jìn)入細(xì)胞的載體，在基因治療方面的應(yīng)用。我們首先采用有熒光標(biāo)記的雙股DNA(20個(gè)堿基對(duì))連接的SWNTs(SWNTs-dsDNA-FAM)確定了功能化的SWNTs進(jìn)入不同細(xì)胞的能力。在這里，我們分別調(diào)查了SWNTs介導(dǎo)的DNA在免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞和不同腫瘤細(xì)胞的體外和體內(nèi)傳遞。對(duì)于免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SWNTs-dsDNA-FAM確實(shí)可以進(jìn)入具有吞噬作

8、用的單核細(xì)胞RAW264.7，而且也可以進(jìn)入成熟和未成熟的樹突細(xì)胞，但由于成熟的樹突細(xì)胞吞噬能力降低，所以進(jìn)入較少。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SWNTs-dsDNA-FAM優(yōu)先被大的鼠脾細(xì)胞吸收，一些小細(xì)胞群如T細(xì)胞和B細(xì)胞不能吸收。進(jìn)一步分析表明，它可以被CD11b+細(xì)胞吸收。對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞，通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀清楚顯示鼠肺癌細(xì)胞、鼠宮頸癌細(xì)胞、鼠卵巢癌表皮細(xì)胞都能很好的吸收SWNTs-dsDNA-FAM。并且體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均沒有觀察到

9、明顯的毒性。隨后，我們又制備了正電荷負(fù)載的SWNTs(SWNT-CONH-(CH2)6-NH3+Cl-，SWNTs+)，然后分別用CD80siRNA和鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA(murinetelomerasereversetranscriptasesiRNA，mTERTsiRNA)與SWNTs+形成復(fù)合物，SWNTs上的正電荷顯著增強(qiáng)了siRNA在SWNTs上的負(fù)載。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，CD80siRNA:SWNT+復(fù)合物可以進(jìn)入成熟

10、和未成熟的樹突細(xì)胞等免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞并導(dǎo)致特定基因表達(dá)降低。同時(shí)體內(nèi)注射也顯示該復(fù)合物可以優(yōu)先被腫瘤相關(guān)性Gr-1+CD11b+細(xì)胞吸收并降低目標(biāo)基因。這為利用SWNTs轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)行體內(nèi)免疫治療提供了可能性。另一方面，mTERTsiRNA:SWNTs+復(fù)合物可以快速進(jìn)入三種鼠腫瘤細(xì)胞，抑制mTERT表達(dá)和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。而且將該復(fù)合物注入植有Lewis肺癌的小鼠體內(nèi)，顯示腫瘤生長(zhǎng)被抑制。這些結(jié)果表明正電荷負(fù)載的SWNTs可以高效攜帶si