對(duì)東方粘蟲(chóng)、亞洲玉米螟具有抗蟲(chóng)作用的Bt蛋白篩選與分析.pdf

1、目前玉米是世界上種植面積最大、種植量最廣的糧食作物。由于全球氣候變暖與當(dāng)前單一的種植模式使得病蟲(chóng)害逐年加重，因此玉米害蟲(chóng)的防治是當(dāng)前最主要的任務(wù)。由于化學(xué)防治產(chǎn)生了諸多負(fù)面影響，亟需生物防治途徑來(lái)解決這一問(wèn)題。蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis）產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白是主要的殺蟲(chóng)成分，已有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)晶體蛋白對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種昆蟲(chóng)，以及一些線蟲(chóng)、螨類(lèi)和原生動(dòng)物具有特異性的

2、殺蟲(chóng)活性。因此廣泛用于世界各國(guó)的農(nóng)業(yè)生物防治中。
　　由于Bt毒素具有昆蟲(chóng)特異性，故篩選出對(duì)特定害蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性的蛋白，有利于針對(duì)性的防治害蟲(chóng)。
　　本文首先對(duì)大腸桿菌中表達(dá)蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)了18℃與30℃兩個(gè)誘導(dǎo)溫度和0.1 mmol/L、0.5 mmol/L及1.0 mmol/L三個(gè)IPTG終濃度。通過(guò)反復(fù)摸索發(fā)現(xiàn):Cry1Bb在18℃，IPTG終濃度為1.0 mmol/L時(shí)可溶組分表達(dá)量最高，30℃，IP

3、TG終濃度為0.1 mmol/L時(shí)不可溶組分表達(dá)量最高;Cry1Be在30℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L時(shí)可溶組分表達(dá)量最高，30℃，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，不可溶組分表達(dá)量最高;Cry9Ee在30℃，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)可溶組分表達(dá)量最高，18℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L時(shí)不可溶組分表達(dá)量最高。
　　針對(duì)玉米主要害蟲(chóng)鱗翅目夜蛾科的東方粘蟲(chóng)Mythimna separata(

4、Walker)進(jìn)行了生物活性測(cè)定，結(jié)果表明，Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白對(duì)東方粘蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性，其致死中濃度依次為5.09、17.71、26.75、27.42及43.93μg/g; Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白對(duì)東方粘蟲(chóng)有生長(zhǎng)抑制作用，其濃度為10μg/g時(shí)的體重抑制率分別為78.4％、79.0％、86.9％，濃度為100μg/g時(shí)的體重抑制率分別為92.8％、95.7％、96

5、.7％; Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白對(duì)東方粘蟲(chóng)無(wú)顯著活性。
　　對(duì)鱗翅目螟蛾科的亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)進(jìn)行了活性篩選，發(fā)現(xiàn)Cry1Bb、Cry1Be對(duì)亞洲玉米螟具有殺蟲(chóng)活性，其致死中濃度LC50分別為0.46μg/g和24.01μg/g。
　　對(duì)本實(shí)驗(yàn)室新基因ng1進(jìn)行了表達(dá)載體的構(gòu)建、蛋白的表達(dá)與殺蟲(chóng)活性分析。由于本實(shí)驗(yàn)室前期的pEB-ng表達(dá)載體在各個(gè)條件下表達(dá)

6、量均很低，故本研究對(duì)其進(jìn)行了載體的更換，構(gòu)建了pET21 b-ng1表達(dá)載體，并在大腸桿菌Rosetta中得到了大量的表達(dá)。另外，測(cè)定了此蛋白對(duì)小菜蛾P(guān)lutella xylostella(Linnaeus)、大猿葉甲Colaphellus bowringi(Baly)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera(Hübner)東方粘蟲(chóng)Mythimnaseparata(Wa