無芒隱子草（Cleistogenes songorica）種質(zhì)抗旱評價(jià)、cDNA文庫構(gòu)建及相關(guān)基因克隆與鑒定.pdf

1、野生植物攜帶有潛在的特異基因和變異基因，通過功能基因組的研究和基因挖掘，可揭示此類植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的特異機(jī)制，為農(nóng)作物和草類植物的基因改良奠定基礎(chǔ)。無芒隱子草(Cleistogenes songorica）為旱生性多年生草類，其極端抗旱性及作為沙漠草原恢復(fù)重建種的潛在價(jià)值已逐漸得到認(rèn)可。本研究從收集我國極抗旱野生無芒隱子草種質(zhì)資源、分析種質(zhì)抗旱特性基礎(chǔ)上，構(gòu)建其干旱脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫；通過高通量測序技術(shù)平臺獲得大量cDNA序列；通過高

2、性能生物信息學(xué)平臺挖掘無芒隱子草抗旱功能基因組信息，進(jìn)行抗旱相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物分析、轉(zhuǎn)基因模式植物(擬南芥)的功能驗(yàn)證，確定目標(biāo)基因的功能，為這些基因在草類作物遺傳改良中的利用奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)論如下。 收集到我國16份野生無芒隱子草種質(zhì)資源，采用RAPD標(biāo)記分析了無芒隱子草種群遺傳多樣性。用篩選得到的7個(gè)隨機(jī)引物，共擴(kuò)增出52條DNA片段，其中23條為多態(tài)性片段。分子變異分析(AMOVA)結(jié)果顯示，種群間的變異占總變異的53.1

3、9％，種群內(nèi)不同個(gè)體間的變異占總變異的46.81％，種群間的變異存在著顯著性差異(P<0.001)。聚類分析將無芒隱子草16個(gè)種群大致劃分為3個(gè)聚類組：第一個(gè)聚類組包括10個(gè)種群，即：pop1～pop5、pop7、pop13～pop16：第2個(gè)聚類組包括pop6、pop8、pop11和pop12；第3個(gè)聚類組包括pop9和pop10。 以無芒隱子草遺傳差異較大的三個(gè)種群CS01，CS09和CS15為材料，通過觀察其幼苗體內(nèi)水分、

4、光合作用參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合色素等特征，研究其在持續(xù)干旱及復(fù)水期間忍耐極端干旱的保護(hù)機(jī)制。證實(shí)這三個(gè)種群響應(yīng)干旱脅迫能力存在差異。干旱脅迫過程中，無芒隱子草仍保持相對較高的葉片相對含水量(75％)和葉水勢(-3.2MPa)，屬于高水勢耐旱型植物；光合器官和光合色素含量在干旱脅迫下受到嚴(yán)重影響；而光化學(xué)器官的功能影響不大，除PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm略有下降外，其它光化學(xué)參數(shù)都變化不大。無芒隱子草在持續(xù)缺水的環(huán)境下，光合速率持續(xù)

5、下降，而胞間CO2濃度變化卻不明顯，兩者變化方向不一致，故初步判斷無芒隱子草凈光合速率下降歸因于葉肉細(xì)胞同化能力的降低。 采用SMART技術(shù)，構(gòu)建了無芒隱子草的輕度干旱脅迫根和葉、極度干旱脅迫根和葉共4個(gè)cDNA文庫，文庫Cs01L、Cs02R、Cs03L和Cs04R的重組率分別為78.6％、100％、78.6％和71.4/％，插入片段大小在0.2～2.8kb之間。采用5’端隨機(jī)測序的策略對無芒隱子草不同材料來源的全長cDNA文

6、庫進(jìn)行了測序，共獲得5664條序列。去除載體和污染序列，并將50bp以下序列剔除后共計(jì)獲得3579條高質(zhì)量序列，總序列長度達(dá)到2，191，166bp，平均每個(gè)EST長度為613bp。把獲得的高質(zhì)量EST使用phrap進(jìn)行組裝和去冗余后獲得1499個(gè)重疊群，包括805個(gè)獨(dú)立非冗余序列和694個(gè)多成員非冗余序列。基因功能注釋(GO)采用與UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的匹配，60％(899條)無芒隱子草序列得到GO功能注釋術(shù)語。這些GO術(shù)語中包

7、含分子功能、生物過程、細(xì)胞組分三個(gè)層次，分別占22％、46％和32％。功能注釋顯示脅迫響應(yīng)基因63個(gè)，其中與抗旱密切相關(guān)的基因25個(gè)。使用國際上通用的SSR引物設(shè)計(jì)軟件，對1499個(gè)無芒隱子草EST(長度共計(jì)1.03Mb)進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記的鑒定，共找到161個(gè)SSR特異分子標(biāo)記。 采用RACE法等相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步克隆無芒隱子草22個(gè)抗旱相關(guān)基因全長序列，已經(jīng)獲得全長序列10個(gè)。geNorm程序獲得無芒隱子草7個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)

8、定度由高到低依次為：CsEIF5_2>CsEIF5_1>CsGAPDH>CsActin-11>CsUBQ>CsTUA2>CsHistone，以表達(dá)相對最穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因GAPDH、CsEIF5_1、CsEIF5_2獲得定量PCR實(shí)驗(yàn)中相對定量或絕對定量數(shù)據(jù)的所有標(biāo)準(zhǔn)化因子，以標(biāo)準(zhǔn)化因子對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過RT-PCR、qPCR相對定量來鑒定無隱子芒草22個(gè)抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)基因的表達(dá)是由干旱脅迫誘導(dǎo)的，并且受干旱脅迫

9、的差異調(diào)控較顯著，在脅迫過的根和葉中的表達(dá)都較對照增加3倍以上；qPCR絕對定量進(jìn)一步研究7個(gè)基因在不同組織、不同脅迫處理(干旱脅迫0天、4天、6天、8天、10天、以及恢復(fù)澆水后l天和4天共7個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn))的表達(dá)情況，揭示了這些基因在適應(yīng)干旱環(huán)境過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。 CsALDH基因在干旱脅迫下根系中相對表達(dá)量是對照的17倍。相對定量和絕對定量結(jié)果顯示CsLEA2基因只在脅迫誘導(dǎo)下才表達(dá)，此基因在脅迫4天后的根中低水平表達(dá)，脅