豬病毒性腹瀉病原ELISA及Luminex檢測(cè)方法研究.pdf

1、引起豬腹瀉的病毒性病原主要有豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV）和輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRV)），其中PEDV與TGEV同屬于冠狀病毒科，是最重要的兩種病原，引起發(fā)病豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水，各年齡的豬均都可感染，死亡率可高達(dá)100％。我國(guó)大部分省市地區(qū)都

2、有這兩種病發(fā)生的報(bào)道，臨床上常呈混合感染，或繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。目前實(shí)驗(yàn)室診斷方法以病毒分離鑒定、PCR擴(kuò)增技術(shù)為主。病毒分離周期長(zhǎng)，且難度大；而PCR檢測(cè)存在一定比例的假陽性。
　　本研究利用生物素-親和素具有高親和性的特性，將PEDV和TGEV IgG抗體分別進(jìn)行生物素標(biāo)記，并以商品化PEDV S蛋白單克隆抗體和TGEV S蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，分別建立了檢測(cè)PEDV、TGEV的生物素-親和素系統(tǒng)雙抗體夾心

3、ELISA檢測(cè)方法，并初步建立單一病原檢測(cè)的Luminex體系，為后續(xù)豬腹瀉病原的多重檢測(cè)方法研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.PEDV雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
　　以體外表達(dá)的PEDV S蛋白作為抗原，商品化抗PEDV S蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的抗PEDV IgG作為檢測(cè)抗體，建立了PEDV生物素-親和素系統(tǒng)雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明，該方法可以檢測(cè)到PEDV S蛋白的最低檢測(cè)限量為20ng/ul，且

4、穩(wěn)定性和特異性較好。利用該方法對(duì)采集的25份臨床豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出3份PEDV陽性樣品，與RT-PCR檢測(cè)方法的符合率為100%。
　　2.TGEV雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
　　以商品化的TGEV S蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，純化的TGEV細(xì)胞毒作為抗原，生物素標(biāo)記的抗TGEV IgG作為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)TGEV的生物素-親和素系統(tǒng)雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明，該方法可檢測(cè)TGEV細(xì)胞毒的最低濃

5、度為17.5ng/μl，敏感性較好。此外，利用該方法對(duì)采集的25份臨床豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出1份TGEV陽性樣品，與RT-PCR檢測(cè)方法的符合率為100%。
　　3.PEDV、TGEV Luminex方法初步建立
　　應(yīng)用xMAP液相芯片技術(shù)原理，以建立的雙抗夾心反應(yīng)條件為參照，用偶聯(lián)微球的商品化單克隆抗體和生物素化IgG抗體，初步建立了捕獲PEDV、TGEV病原的LiquiChip液相蛋白芯片檢測(cè)方法。
　　本