微衛(wèi)星雜合性缺失檢測(cè)多結(jié)節(jié)性和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌克隆起源及其臨床意義.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤。雖然手術(shù)治療明顯改善了肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后，但總體上肝細(xì)胞癌術(shù)后5年生存率為40％左右，其中多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)是嚴(yán)重阻礙患者手術(shù)遠(yuǎn)期療效的兩個(gè)重要瓶頸。了解多結(jié)節(jié)性和術(shù)后復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌的生物學(xué)特性與治療模式和預(yù)后的關(guān)系，可以為臨床上更合理的個(gè)體化治療肝細(xì)胞癌提供有用的理論依據(jù)。 多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌和術(shù)后復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌克隆

2、起源方式可分為肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(intrahepatic metastasis，IM)和多中心發(fā)生(multicentric occurrence，MO)兩種情況，前者屬于單克隆起源，而后者為多克隆起源。判斷肝細(xì)胞癌克隆起源對(duì)于患者治療方案選擇以及評(píng)估預(yù)后十分必要。從理論上講，如果某個(gè)多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌為MO，那么各個(gè)結(jié)節(jié)的生物學(xué)行為與單發(fā)病灶的肝細(xì)胞癌相同，手術(shù)療效優(yōu)于肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。但如果多結(jié)節(jié)病灶為IM，即肝內(nèi)的多個(gè)病灶為癌細(xì)胞在肝內(nèi)的擴(kuò)散，由于

3、手術(shù)難以切除全部癌灶而可能導(dǎo)致手術(shù)治療效果不佳或失敗。同樣，復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)病灶既可能是IM，即術(shù)后復(fù)發(fā)的肝細(xì)胞癌來(lái)自術(shù)后肝內(nèi)殘留的病灶，也可能是MO，此類(lèi)術(shù)后再次出現(xiàn)肝細(xì)胞的癌變，產(chǎn)生新的腫瘤，即第二次原發(fā)癌灶。 長(zhǎng)期以來(lái)臨床上缺乏有效的標(biāo)志物檢測(cè)肝細(xì)胞癌克隆起源。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者試圖從臨床病理學(xué)特點(diǎn)和分子生物學(xué)特性方面鑒別肝細(xì)胞癌的克隆起源，經(jīng)過(guò)多年的嘗試，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)DNA倍體分析、p53基因突變差異位點(diǎn)分析、HBV-DN

4、A整合位點(diǎn)分析以及X染色體失活連鎖的HUMARA等檢測(cè)方法雖然各自均具有一定的優(yōu)勢(shì)，但是也都有明顯的缺欠。目前認(rèn)為，肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的多階段、多步驟的演變過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中涉及到的一系列遺傳學(xué)改變(如癌基因的激活、抑癌基因的失活等)是其發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的很多腫瘤存在基因或基因組不穩(wěn)定性或者遺傳不穩(wěn)定性。肝細(xì)胞癌中，發(fā)生在染色體1p，4q，5q，8p，8q，9p，10q，11p，13q，14q，16q

5、，17p和22q上的雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)十分常見(jiàn)，提示緊密連鎖這些染色體區(qū)域上的相關(guān)抑癌基因在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。多結(jié)節(jié)性和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌中不同結(jié)節(jié)之間出現(xiàn)不同LOH模式顯示它們由不同的腫瘤克隆組成，提示其多克隆起源和多發(fā)灶性發(fā)展。從技術(shù)上講，微衛(wèi)星LOH分析對(duì)于DNA含量少的標(biāo)本，如針吸活檢或者肝組織活檢均適用，因此有助于在術(shù)前了解腫瘤的克隆來(lái)源。此外，對(duì)于福爾馬林固定石

6、蠟包埋的存檔肝細(xì)胞癌標(biāo)本，在顯微組織切割基礎(chǔ)上亦可有效地提取基因組DNA進(jìn)行LOH檢測(cè)。 研究目的： (1)選擇不同染色體上15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌進(jìn)行LOH分析，通過(guò)比較各腫瘤結(jié)節(jié)間LOH模式的異同，借此區(qū)分肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和多中心發(fā)生； (2)建立一組具有較高M(jìn)O檢出率的微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)譜； (3)比較研究肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和多中心發(fā)生肝細(xì)胞癌的臨床病理學(xué)特點(diǎn)，并進(jìn)一步探討復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌克隆起源

7、不同對(duì)預(yù)后的影響。 研究方法： 根據(jù)我科前期關(guān)于肝細(xì)胞癌基因組不穩(wěn)定以及小肝細(xì)胞癌微衛(wèi)星變異特點(diǎn)的相關(guān)研究結(jié)果，選擇7個(gè)高頻微衛(wèi)星LOH位點(diǎn)。此外，另選擇8個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的微衛(wèi)星LOH位點(diǎn)。以手術(shù)切除的40例復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌和30例多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌為主要研究對(duì)象。首先根據(jù)癌結(jié)節(jié)的組織病理學(xué)對(duì)其克隆起源進(jìn)行判斷。然后經(jīng)顯微切割技術(shù)分別獲取腫瘤和癌旁肝組織，經(jīng)DNA抽提和微衛(wèi)星PCR-SSCP檢測(cè)，分析腫瘤微衛(wèi)星LOH，比較多結(jié)節(jié)

8、性和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌中多個(gè)癌結(jié)節(jié)不同微衛(wèi)星位點(diǎn)LOH的差異，作為判斷肝細(xì)胞癌克隆起源的分子依據(jù)，并通過(guò)毛細(xì)管電泳測(cè)序驗(yàn)證微衛(wèi)星PCR-SSCP檢測(cè)LOH的準(zhǔn)確性。 結(jié)果： 判斷克隆起源的標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)同一病例中不同腫瘤結(jié)節(jié)的15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行LOH分析，當(dāng)信息性位點(diǎn)上各腫瘤結(jié)節(jié)LOH模式均相同，判斷為IM；當(dāng)各腫瘤結(jié)節(jié)出現(xiàn)不同LOH模式的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)目/信息性位點(diǎn)總數(shù)大于30％，則判斷為MO；而小于30％則為無(wú)法判斷克隆起源(

9、UD)。 30例多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌中，15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)生LOH的頻率從22.2％到56.9％，平均為36.7％。多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌中，33.3％(10/30)和60.0％(18/30)的患者分別診斷為MO以及IM，2例(6.7％)患者無(wú)法判斷克隆來(lái)源，形態(tài)學(xué)和PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果差異率為23.3％(7/30)。 40例復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌病例中，15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)生LOH的頻率從26.8％到46.9％，平均為37.5％。復(fù)發(fā)

10、性肝細(xì)胞癌中，30.0％(12/40)和65％(26/40)的患者分別診斷為MO和IM，2例(5％)患者無(wú)法判斷克隆來(lái)源，形態(tài)學(xué)和PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果差異率為22.5％(9/40)。 從上面2組研究對(duì)象中各隨機(jī)抽取4例配對(duì)樣本進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序，其結(jié)果與PCR-SSCP分析LOH的結(jié)果一致。 70例研究對(duì)象中，22例診斷為MO，其中有59.1％(13/22)均檢測(cè)到D4S402、D4S406位點(diǎn)LOH模式不同，此外D

11、17S831、D16S505、D17S938和D8S277這4個(gè)位點(diǎn)LOH模式不同占MO患者總數(shù)也均高于30％；而D8S258和D8S520位點(diǎn)則小于10％。剔除：D8S258即14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)即可將22位MO病例檢測(cè)出來(lái)。 將66例明確克隆起源的肝細(xì)胞癌分為MO和IM組，比較二組臨床病理指標(biāo)的不同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二組在腫瘤大小、腫瘤是否侵犯血管、組織學(xué)分級(jí)和肝臟伴隨病變上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌中，MO和IM組至疾病進(jìn)展時(shí)間分

12、別為(33.75±4.45)月和(14.23±2.54)月，MO組明顯長(zhǎng)于IM組(P=0.001)。 結(jié)論： 1．選擇位于多條染色體(1，4，8，13，16和17)上的15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，應(yīng)用PCR-SSCP方法對(duì)多結(jié)節(jié)性和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌中不同腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行LOH分析，根據(jù)癌結(jié)節(jié)LOH模式的異同，可以在分子生物學(xué)水平上判斷多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌的克隆起源。該方法是彌補(bǔ)組織形態(tài)學(xué)診斷不夠準(zhǔn)確的理想方法之一。

13、2．聯(lián)合15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與聯(lián)合14個(gè)位點(diǎn)(除外D8S258)在判斷肝細(xì)胞癌克隆起源上具有同樣的準(zhǔn)確率。其中，在多中心發(fā)生肝細(xì)胞癌中檢出D4S402、D4S406、D17S831、D16S505、D17S938和D8S277位點(diǎn)上存在不同LOH模式的比例均超過(guò)30％，提示該6個(gè)位點(diǎn)更為敏感和特異，可以作為鑒別多中心發(fā)生肝細(xì)胞癌的首選位點(diǎn)。 3．對(duì)石蠟切片進(jìn)行顯微切割獲取腫瘤組織DNA，結(jié)合PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行LOH分析簡(jiǎn)單、經(jīng)

14、濟(jì)、可行，且電泳條帶和毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果基本一致。 4．雖然組織學(xué)檢查不能作為判斷肝細(xì)胞癌克隆起源的主要依據(jù)，但在肝硬化基礎(chǔ)上，腫瘤體積較小，腫瘤無(wú)血管侵犯，組織學(xué)分化好、復(fù)發(fā)問(wèn)期時(shí)間長(zhǎng)與肝細(xì)胞癌多中心發(fā)生密切相關(guān)。將臨床病理學(xué)指標(biāo)、組織形態(tài)學(xué)以及微衛(wèi)星LOH檢測(cè)相結(jié)合可以對(duì)多結(jié)節(jié)性和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌的克隆起源做出比較準(zhǔn)確的判斷。 5．通過(guò)對(duì)復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌生存分析發(fā)現(xiàn)，多中心發(fā)生的復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌在第一次手術(shù)切除后至下一次肝