氟西汀長(zhǎng)期給藥后活體動(dòng)物腦內(nèi)特異性基因的表達(dá)和編輯及在慢性應(yīng)激快感缺失后基因表達(dá)的改變.pdf

1、目的：
　　氟西汀作為一種五羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)，一方面能夠抑制五羥色胺的再吸收，提高突觸間隙中五羥色胺的濃度，另一方面可以結(jié)合并激活5-HT2B受體，引起細(xì)胞內(nèi)部鈣離子濃度增加，激活鋅依賴性的金屬蛋白酶(MMPs)，導(dǎo)致某些生長(zhǎng)因子釋放，比如表皮生長(zhǎng)因子HB-EGF的釋放。近年來人們比較關(guān)注于氟西汀對(duì)行為學(xué)相關(guān)基因的影響，這些與行為學(xué)相關(guān)的基因包括:5-HT2受體，其中包括5-HT2B(Htr2b)和5-HT2C(Ht

2、r2c);編碼cPLA磷脂酶基因cpla2，其中包括cPLA2a(Pla2g4a);還有編碼GluK2的海藻氨酸鹽受體基因Grik2和編碼GluK4的海藻氨酸鹽受體基因Grik4。
　　RNA腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminases acting in RNA，ADARs）是一種酶家族，可將某些mRNA腺嘌呤核苷去氨基酸轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷，即A-to-I轉(zhuǎn)換。ADARs可編輯5-HT2受體和GluK2的mRNA表達(dá)。

3、
　　熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)的方法可根據(jù)細(xì)胞特異性標(biāo)記物分選出新鮮分離轉(zhuǎn)基因鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞，通過這一方法可以進(jìn)一步驗(yàn)證我們之前在原代細(xì)胞培養(yǎng)和整體動(dòng)物中的結(jié)果，另一方面也可以克服原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞不能進(jìn)行氟西汀慢性處理的缺點(diǎn)。
　　動(dòng)物模型的建立對(duì)于了解應(yīng)激誘導(dǎo)的行為學(xué)改變的病理生理及形成有效的治療方案來說極其重要。理想的慢性應(yīng)激動(dòng)物

4、模型能夠復(fù)制出應(yīng)激應(yīng)答的各個(gè)方面并能夠模擬疾病的發(fā)生。我們研究組建立了小鼠的抑郁模型，快感缺失是抑郁的主要特征，通過糖水?dāng)z取試驗(yàn)檢測(cè)快感缺失?？梢匝芯糠魍?duì)快感缺失小鼠腦內(nèi)細(xì)胞上述基因mRNA表達(dá)，這使得人們研究氟西汀對(duì)抑郁癥又進(jìn)了一步。
　　方法：
　　建立轉(zhuǎn)基因小鼠的抑郁模型，應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)小鼠在慢性應(yīng)激刺激快感缺失情況下的5-HT2B受體，5-HT2C受體，cPLA2a，ADAR2，GluK2及G

5、luK4基因的表達(dá)。氟西?。?0 mg/kg）腹腔注射轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察氟西汀和（或）慢性應(yīng)激快感缺失對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞5-HT2B受體，5-HT2C受體，cPLA2，ADAR2，GluK2及GluK4基因表達(dá)的影響。并且，經(jīng)PCR測(cè)序研究氟西汀對(duì)5-HT2B受體與GluK2 RNA編輯的影響。使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

6、結(jié)果：
　　1、Cfos和fosB mRNA表達(dá)
　　氟西汀10 mg/Kg腹腔注射2小時(shí)后取腦，觀察氟西汀對(duì)極早基因cfos和fosB表達(dá)的影響。在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中，cfos和fosB mRNA表達(dá)上調(diào)。
　　2、五羥色胺轉(zhuǎn)載體mRNA表達(dá)
　　五羥色胺轉(zhuǎn)載體在整體動(dòng)物的星形膠質(zhì)細(xì)胞中沒有表達(dá)，這與之前我們?cè)谠切文z質(zhì)細(xì)胞中得出的結(jié)果一致。
　　3、慢性應(yīng)激誘導(dǎo)快感缺失轉(zhuǎn)基因小鼠基因表達(dá)

7、>　　(1)5-HT2B受體mRNA水平
　　在正常組轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有5-HT2B受體表達(dá)。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組星形膠質(zhì)細(xì)胞中5-HT2B受體表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。而在慢性應(yīng)激刺激快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠中，星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體表達(dá)水平是顯著下降的(P＜0.01)，經(jīng)氟西汀慢性處理(2周)的快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠5-HT2B受體表達(dá)水平顯著上升(P＜0.05)，并與未經(jīng)

8、氟西汀處理的正常組轉(zhuǎn)基因小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體表達(dá)水平無顯著差異。神經(jīng)元細(xì)胞5-HT2B受體表達(dá)水平未受到氟西汀長(zhǎng)期給藥及慢性應(yīng)激處理后快感缺失的影響。
　　(2)5-HT2C受體mRNA水平
　　在正常轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有5-HT2C受體表達(dá)。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉(zhuǎn)基因動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞5-HT2C受體表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。經(jīng)慢性應(yīng)激刺激快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞較正常

9、組轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞5-HT2C受體表達(dá)水平相比無顯著性改變，而經(jīng)氟西汀慢性處理后快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞5-HT2C受體表達(dá)水平顯著上升(P＜0.01)，并與經(jīng)氟西汀處理的正常組轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞5-HT2C受體表達(dá)水平無顯著差異。即5-HT2C受體表達(dá)未受慢性應(yīng)激處理后快感缺失的影響。星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2C受體表達(dá)未受到氟西汀長(zhǎng)期給藥及慢性應(yīng)激處理后快感缺失的影響。
　　(3) cPLA2a mRNA表達(dá)水平

10、>　　在正常轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有cPLA2a受體表達(dá)。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，在正常組轉(zhuǎn)基因動(dòng)物星形膠質(zhì)細(xì)胞中cPLA2a表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。慢性應(yīng)激刺激后快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)水平較正常組轉(zhuǎn)基因鼠表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，而在經(jīng)氟西汀慢性處理后快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)水平顯著上升(P＜0.05)，并與正常組轉(zhuǎn)基因小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)水

11、平無顯著差異。轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞cPLA2a表達(dá)水平均未受氟西汀長(zhǎng)期給藥及慢性應(yīng)激處理后快感缺失的影響。
　　(4) ADAR2 mRNA表達(dá)水平
　　在正常轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有ADAR2表達(dá)。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉(zhuǎn)基因動(dòng)物星形膠質(zhì)細(xì)胞中ADAR2表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。經(jīng)慢性應(yīng)激刺激后快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠無論是否進(jìn)行氟西汀慢性處理星形膠質(zhì)細(xì)胞ADAR2表達(dá)水平均較正常組轉(zhuǎn)基因小鼠

12、ADAR2表達(dá)下降(P＜0.01)。神經(jīng)元細(xì)胞ADAR2表達(dá)水平未受到氟西汀長(zhǎng)期給藥及慢性應(yīng)激處理后快感缺失的影響。
　　(5) Gluk2 mRNA表達(dá)水平
　　在正常轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有Gluk2表達(dá)。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，在正常組轉(zhuǎn)基因動(dòng)物星形膠質(zhì)細(xì)胞Gluk2表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。而經(jīng)慢性應(yīng)激刺激后快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠無論是否經(jīng)過氟西汀處理星形膠質(zhì)細(xì)胞Gluk2表達(dá)水平均較正常組轉(zhuǎn)

13、基因小鼠相比無明顯變化。轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞Gluk2表達(dá)水平未受到氟西汀長(zhǎng)期給藥及慢性應(yīng)激處理后快感缺失的影響。
　　(6) Gluk4 mRNA表達(dá)水平
　　在正常轉(zhuǎn)基因小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有Gluk4表達(dá)。經(jīng)氟西汀慢性處理（2周）后，正常組轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)元細(xì)胞中Gluk4表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。經(jīng)慢性應(yīng)激刺激后快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠，神經(jīng)元細(xì)胞Gluk4表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)，而經(jīng)氟西汀慢性處

14、理后快感缺失組轉(zhuǎn)基因小鼠Gluk4表達(dá)水平顯著上升(P＜0.05)，并與正常組轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細(xì)胞Gluk4表達(dá)水平無顯著差異。星形膠質(zhì)細(xì)胞Gluk4表達(dá)水平未受到氟西汀長(zhǎng)期給藥及慢性應(yīng)激處理快感缺失的影響。
　　5、Gluk2 RNA編輯
　　轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)流式細(xì)胞分選后分離出星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞，其PCR產(chǎn)物完成GluK2的基因測(cè)序。GluK2的3個(gè)編輯位點(diǎn)（I/V, Y/C和Q/R）可通過測(cè)序得到的校正曲線來計(jì)算其編

15、輯水平。結(jié)果如圖所示。編輯的(V，C，R)和未編輯的(I，Y，Q)的GluK2 PCR產(chǎn)物（上海生工）按100∶0（100％編輯），90∶10，80∶20，70∶30，60∶40比例得出GluK2 RNA編輯的校正曲線，正常對(duì)照組和氟西汀腹腔注射組可通過該校正曲線得到星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞相應(yīng)的GluK2 G/G+A比率。結(jié)果得出，在正常對(duì)照組，星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞I/V位點(diǎn)編輯比率大約為84％，Y/C位點(diǎn)編輯比率為82％，Q/R

16、位點(diǎn)的編輯比率為82％。在氟西汀處理2周的整體動(dòng)物中，在神經(jīng)元細(xì)胞3個(gè)位點(diǎn)的編輯比率沒有發(fā)生變化，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中I/V位點(diǎn)編輯比率大約為92％，Y/C位點(diǎn)編輯比率為89％，Q/R位點(diǎn)的編輯比率為90％。這提示氟西汀誘導(dǎo)了星形膠質(zhì)細(xì)胞GluK2的mRNA編輯。
　　6、5-HT2B受體RNA編輯
　　在神經(jīng)元細(xì)胞中，無論氟西汀處理與否，測(cè)序結(jié)果提示5-HT2B受體的8個(gè)編輯位點(diǎn)均未編輯，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)照組未經(jīng)處理的