大鼠出生后聽皮層神經(jīng)元電生理特性的發(fā)育變化及聽覺丘腦-皮層腦片突觸傳遞的研究.pdf

1、動物出生后2-4周，聽覺通路的各個(gè)部分及彼此之間的神經(jīng)纖維聯(lián)系逐漸發(fā)育成熟并構(gòu)成一個(gè)完整的神經(jīng)回路。位于丘腦的內(nèi)側(cè)膝狀體(medialgeniculatebody，MGB)是特異的聽覺中繼站，其神經(jīng)元發(fā)出的上行性纖維呈扇形經(jīng)內(nèi)囊投射至初級聽皮層(primararyauditorycortex，A1，Te1)及其它聽覺皮層的相應(yīng)區(qū)域，其中始于內(nèi)側(cè)膝狀體腹側(cè)部(theventralpartionofmedialgeniculatebody，

2、MGBv)的聽覺丘腦皮層上行通路稱為初級聽覺丘腦皮層通路，主要介導(dǎo)對聲刺激的短潛伏期反應(yīng)以及運(yùn)載關(guān)于刺激頻率、強(qiáng)度和時(shí)程的精確信息，并且影響初級聽皮層神經(jīng)元對輸入信息的處理及反應(yīng)形式，在聽覺系統(tǒng)中起著非常重要的作用。 隨著膜片鉗技術(shù)的不斷成熟，不僅可在傳統(tǒng)的冠狀或是矢狀位的腦片切片上分別研究MGB或初級聽皮層神經(jīng)元的電生理特性的發(fā)育變化，而且根據(jù)對大鼠聽覺丘腦一皮層投射纖維的穩(wěn)定走行的長期解剖學(xué)方面的研究結(jié)果，通過改換腦片切片時(shí)

3、的角度可以在離體腦片上保存好MGBv與初級聽皮層(primararyauditorycortex，A1)以及二者之間的較完整的纖維聯(lián)系，從而使得在腦片上對更大范圍的聽覺神經(jīng)元間突觸傳遞機(jī)制的研究成為可行，并且可以在腦片上極其便利的了解A1神經(jīng)元對傳入信息所發(fā)生的突觸后反應(yīng)及其細(xì)胞機(jī)制。 為此，本課題采用腦片膜片鉗技術(shù)和方法，對出生后P3-30d的大鼠A1神經(jīng)元的電生理及形態(tài)學(xué)特性的發(fā)育變化進(jìn)行較系統(tǒng)的了解，以及在聽覺丘腦皮層腦片

4、上研究刺激MGB或聽覺丘腦-皮層通路誘發(fā)的A1神經(jīng)元突觸后電生理學(xué)反應(yīng)的形式及特點(diǎn)。 第一部分：采用腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，研究出生后不同發(fā)育階段大鼠的A1神經(jīng)元膜學(xué)特性、電壓依賴性離子通道變化，及biocytin細(xì)胞內(nèi)染色，結(jié)果顯示如下：1.P3-11d(postnatalday，出生后)，不同天齡A1神經(jīng)元的RMP(restingmembranepotential)、Ri(inputresistance)和Tau(time

5、constant)的差異非常顯著，P12d后基本不再發(fā)生變化。在P3-12d的發(fā)育期，膜電位從-40mV超極化至-68mV。靜息膜電位的超極化可能與Na+/K+泵活性增強(qiáng)以及K+電流的增加或cl-翻轉(zhuǎn)電位的降低有關(guān)。隨著膜面積的延伸，離子通道密度相應(yīng)增加可解釋在發(fā)育過程中輸入阻抗的降低。 2.不同天齡A1神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环群蜁r(shí)程在P3-11d差異顯著，之后基本不再發(fā)生變化。 3.在A1神經(jīng)元發(fā)育過程中，其電壓依賴性離子通

6、道的變化影響了出生后大鼠A1神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏男螒B(tài)。電流鉗記錄方式下，10μmol/L的K+通道阻斷劑4-AP使P8d大鼠聽皮層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环冉档?，時(shí)程變寬，動作電位的數(shù)目減少，使P13d大鼠聽皮層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢恢饾u降低至脈沖終末達(dá)到平臺電位，說明電壓依賴性K+在出生后大鼠聽皮層神經(jīng)元上還未發(fā)育成熟。300nmol/L的Na+通道阻斷劑TTX對P8d和P13d大鼠聽皮層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏淖饔没鞠嗨?，使動作電位的發(fā)放減弱或消失，僅見LT

7、S，表明Na+通道在出生后發(fā)育已較成熟。50μmol/L的Ca2+通道阻斷劑CdCl2引起P8d的聽皮層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放逐漸減弱，在脈沖終末達(dá)到平臺電位，而僅使P13d的聽皮層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆冉档?，時(shí)程延長，表明Ca2+對聽皮層幼稚神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏木S持發(fā)揮了重要的作用。 4.采用腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄和細(xì)胞內(nèi)染色相結(jié)合的技術(shù)，觀察大鼠出生后不同發(fā)育階段的A1神經(jīng)元形態(tài)的變化。Biocytin組化染色結(jié)果表明，隨著出生后天齡

8、的增長，A1神經(jīng)元胞體逐漸呈錐形、短梭形或長梭形，軸突出現(xiàn)較早，軸突自胞體或主樹突近胞體處發(fā)出，樹突發(fā)育相對較晚，但隨著出生后天齡的增長其變化更為明顯，表現(xiàn)為樹突增粗增長，分支增多，樹突野范圍增大，并出現(xiàn)樹突棘。聽皮層超微結(jié)構(gòu)顯示，P3-30d神經(jīng)氈面積逐漸增大，膠質(zhì)細(xì)胞逐漸增多，高爾基器等神經(jīng)元細(xì)胞器發(fā)達(dá)。這些結(jié)果說明，大鼠聽皮層及其神經(jīng)元形態(tài)在出生后尚未發(fā)育成熟，需經(jīng)過一定時(shí)間才能達(dá)到成年水平。 第二部分：改換腦片切片的角度

9、，使腦片包含有部分MGBv和A1神經(jīng)元及其之間較完整的丘腦皮層神經(jīng)纖維突觸聯(lián)系，通過biocytin細(xì)胞外染色以及刺激MGBv神經(jīng)元或丘腦-皮層投射纖維引出皮層神經(jīng)元的突觸后反應(yīng)證明聽覺丘腦皮層通路的存在，觀察A1神經(jīng)元突觸后電活動反應(yīng)形式及特點(diǎn)，了解突觸傳遞在A1神經(jīng)元對傳入信息的整合及處理中的作用機(jī)制。結(jié)果如下：1.聽覺丘腦-皮層腦片制備由于初級聽覺丘腦皮層通路和次級聽覺丘腦皮層通路相互交叉或重疊，盡管它們的功能不同，但是目前的丘腦

10、皮層腦片還無法將它們分別獨(dú)立出來進(jìn)行研究。聽覺丘腦-皮層通路在走行上有幾個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，所以使得400μm厚的腦片往往不能包含一個(gè)較完整的丘腦-皮層系統(tǒng)，刺激MG時(shí)，較少能引起皮層的反應(yīng)，僅在刺激丘腦-皮層通路中的上丘輻射部分時(shí)可以引出皮層反應(yīng)。為了獲得較為完整的丘腦-皮層通路，將切片的厚度由400μm調(diào)整至600μm后可以獲得含有完整丘腦-皮層通路的腦片，刺激MG均可記錄到清晰的，短潛伏期的皮層反應(yīng)。 2.早和晚的突觸后電流將記錄電

11、極置于聽皮層的第Ⅱ-Ⅳ層，通過在亞皮層刺激位點(diǎn)給予幅度0.5mA，時(shí)程100μs的刺激可以在A1細(xì)胞誘導(dǎo)出含有早和晚反應(yīng)成分的突觸后電流(postsynapticcurrents，PSCs)。突觸后電流在細(xì)胞膜去極化時(shí)幅度減小，而超極化時(shí)增大。選擇性的應(yīng)用谷氨酸鹽受體拮抗劑證明谷氨酸鹽受體在突觸后電流產(chǎn)生中的作用。NMDA受體拮抗劑APV(25-50μM)可使早電流成分稍減小，但是可完全阻斷晚電流成分。AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(