去勢(shì)抵抗性前列腺癌伴骨轉(zhuǎn)移自然殺傷細(xì)胞治療的初步臨床研究.pdf

1、目的:研究去勢(shì)抵抗性前列腺癌伴骨轉(zhuǎn)移(metastatic castration resistant prostatecancer mCRPC)患者自體外周血自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞經(jīng)體外大規(guī)模擴(kuò)增后的生物學(xué)特性，初步評(píng)估體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞治療mCRPC的安全性及有效性。
　　方法:
　　1、選擇2013年1月-2014年6月來我院接受治療的去勢(shì)抵抗性前列腺癌伴骨轉(zhuǎn)移患者8例，完成患者的術(shù)前相關(guān)檢查:

2、外周血常規(guī)、肝腎功能、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen PSA)，淋巴細(xì)胞亞群、血清中細(xì)胞因子;臨床影像學(xué)評(píng)估（胸片、B超、X-CT、磁共振、骨掃描）;采用Kamofsky評(píng)分評(píng)估患者生活質(zhì)量;數(shù)字疼痛強(qiáng)度量表(Numerical rating scale NRS)對(duì)每位患者的疼痛進(jìn)行疼痛評(píng)分。抽取患者外周血，每次50ml，共3-4次。
　　2、Ficoll密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(P

3、eripheral blood mononuclearcells PBMC)，NK包被培養(yǎng)瓶為T75培養(yǎng)瓶，接種細(xì)胞用;培養(yǎng)到50 ml體積，變黃時(shí)由一個(gè)T75培養(yǎng)瓶擴(kuò)增到兩個(gè)T75培養(yǎng)瓶，變黃時(shí)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋繼續(xù)培養(yǎng)。后續(xù)補(bǔ)液只需要加GT-T551+1000IU IL-2+10％自體血清。自體血清用完后，加自體血漿，全部用完后可以不加。CD137L(5ug/ml)因子包被培養(yǎng)瓶用;γ干擾素(1000U/ml) d0天加入，1000×，I

4、L-15(2ug/L)補(bǔ)充到GT-T551，IL-1β(1000U/ml)、IL-7(1000U/ml)、IL-12(1000U/ml)、IL-18(1000U/ml)、IL-21(1000U/ml)因子在d1天加入。
　　3、對(duì)體外培養(yǎng)擴(kuò)增的NK細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況、流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞的純度，采用Calcein-AM分析NK細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC-3的殺傷能力，體外鑒定NK細(xì)胞是否具有治療前列腺癌的潛能。細(xì)胞回輸

5、之前經(jīng)過無菌、內(nèi)毒素、支原體等質(zhì)量檢驗(yàn)。
　　4、所有患者均接受自體自然殺傷細(xì)胞輸注治療，其中4例患者接受3次輸注治療，剩下4例患者接受4次輸注治療，完成前列腺癌患者NK細(xì)胞輸注術(shù)后相關(guān)檢查，對(duì)前列腺癌患者細(xì)胞輸注術(shù)后的生活質(zhì)量及疼痛再次進(jìn)行評(píng)分，判斷NK細(xì)胞對(duì)mCRPC治療的安全性和有效性。
　　結(jié)果:
　　1、從抽取的50ml外周血中分離出NK細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，NK細(xì)胞可以達(dá)到1000倍左右的擴(kuò)增效率，總細(xì)胞

6、數(shù)量平均達(dá)到4.39×109，CD3-CD16/56+NK細(xì)胞的純度平均達(dá)到84.3％。
　　2、體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞對(duì)PC-3及K562具有明顯的殺傷作用，在效靶比10∶1時(shí)，對(duì)PC-3及K562的殺傷作用分別為78％和82％。
　　3、NK細(xì)胞回輸完成后第三天檢測(cè)，8例患者當(dāng)中有5例患者出現(xiàn)前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)的下降，2例患者出現(xiàn)PSA的上升，1例患者PSA回輸前后

7、均大于可檢測(cè)上限值（PSA＞10000ng/ml）。7例患者外周血出現(xiàn)CD3-CD56+NK細(xì)胞的比例升高，6例患者外周血出現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的比例升高。
　　4、根據(jù)Kamofsky及NRS評(píng)分，所有患者的生活質(zhì)量均得到改善，骨痛均得到不同程度的緩解，所有患者在輸注過程中及輸注后均未發(fā)生不良反應(yīng)與毒副作用。
　　結(jié)論:
　　1、本次研究中的自體NK細(xì)胞經(jīng)大規(guī)模擴(kuò)增后NK細(xì)胞可以達(dá)到1000倍左右的擴(kuò)增效率，總細(xì)胞數(shù)量平

8、均達(dá)到4.39×109，CD3-CD16/56+NK細(xì)胞的純度平均達(dá)到84.3％。
　　2、自體自然殺傷細(xì)胞的治療具有很好的安全性及耐受性，其初步臨床治療效果較好，mCRPC患者運(yùn)用自然殺傷細(xì)胞進(jìn)行治療應(yīng)該具有較好的前景。
　　3、腫瘤患者輸注治療后，細(xì)胞因子IL2，IL12，IFN及TNF未見明顯上升，7例患者的CD3-CD16/CD56+ NK細(xì)胞及6例患者的CD8+T細(xì)胞比例上升，在某種程度上可喚醒患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答。