大菱鲆對養(yǎng)殖密度、亞硝酸鹽和氨氮脅迫的應激響應機制研究.pdf

1、近年來，隨著大菱鲆養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、地下水資源短缺、疾病困擾以及養(yǎng)殖裝備技術(shù)的改進，大菱鲆工廠化養(yǎng)殖模式逐漸從傳統(tǒng)流水養(yǎng)殖模式向封閉循環(huán)水養(yǎng)殖模式發(fā)展。循環(huán)水養(yǎng)殖模式具有資源節(jié)約、污染低、產(chǎn)品安全等優(yōu)點。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，高養(yǎng)殖密度是循環(huán)水養(yǎng)殖模式的主要優(yōu)勢之一。然而循環(huán)水系統(tǒng)中大菱鲆適宜的放養(yǎng)密度是多少？循環(huán)水系統(tǒng)是否適合大菱鲆高密度養(yǎng)殖？過高的養(yǎng)殖密度如何影響大菱鲆生長與生理狀況？這些均是目前大菱鲆養(yǎng)殖研究中亟待解決的問題。因此在循環(huán)水系

2、統(tǒng)中綜合評價養(yǎng)殖密度對大菱鲆的影響具有重要的意義。
　　在集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，尤其是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，由于養(yǎng)殖密度的提高、過量的投喂、不當?shù)牟僮?、硝化細菌的失衡等因素，通常會引起氨氮和亞硝酸鹽在水體中積累或短暫的升高，對養(yǎng)殖魚類產(chǎn)生不利的影響。然而在大菱鲆中，關(guān)于氨氮和亞硝酸鹽脅迫的報道較少，且其毒性機制尚不明確。因此研究氨氮和亞硝酸鹽對大菱鲆毒性作用具有十分重要的意義。本研究以大菱鲆為對象，首先探究了循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖密度對其生長

3、和生理狀況的影響，并結(jié)合生化指標和分子指標綜合分析其響應機制;其次評估了亞硝酸鹽和氨氮的脅迫作用，從應激、凋亡、免疫等多方面分析其響應機制。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖密度對大菱鲆水質(zhì)、生長與血液生理參數(shù)的影響
　　本研究分三個階段，每個階段設低、中、高三個養(yǎng)殖密度。養(yǎng)殖過程中連續(xù)監(jiān)測水質(zhì)因子、生長參數(shù)和血液生理參數(shù)，并應用主成分分析法(PCA)綜合評估養(yǎng)殖密度對大菱鲆的影響。水質(zhì)數(shù)據(jù)顯示:在三個養(yǎng)殖階

4、段后期，高密度組總氨氮(TAN)和化學需氧量(COD)含量顯著高于低密度組(P＜0.05)。生長數(shù)據(jù)顯示:三個養(yǎng)殖階段末，高密度組大菱鲆體重、體長、絕對生長率(AGR)、特定生長率(SGR)顯著低于低密度組（P＜0.05）;餌料系數(shù)(FCR)和體重差異系數(shù)(Coefficient of variation for weight，CVw)顯著高于低密度組（P＜0.05）;但成活率、肥滿度(K)和鰭指數(shù)沒有明顯變化。血液生理數(shù)據(jù)顯示:三個養(yǎng)

5、殖階段末，與低密度組相比，高密度引起大菱鲆血漿葡萄糖、皮質(zhì)醇、乳酸、膽固醇和甘油三脂含量的顯著升高(P＜0.05)。PCA分析顯示:在三個養(yǎng)殖階段末，高密度組與低密度、中密度組均無交叉，被顯著分為兩類，而低密度和中密度組因子得分值相近，表明養(yǎng)殖密度越高，對大菱鲆生長和生理狀態(tài)越不利。此外結(jié)果還顯示:在本研究條件下，70 g左右的大菱鲆養(yǎng)殖密度不宜超過14.3 kg/m2;180 g左右的大菱鲆養(yǎng)殖密度不宜超過25.7 kg/m2;510

6、 g左右的大菱鲆養(yǎng)殖密度不宜超過52.3 kg/m2。
　　2.循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖密度對大菱鲆滲透壓、抗氧化狀態(tài)和代謝能力的影響
　　通過檢測血液中滲透壓，血液、肝、鰓和皮膚組織中抗氧化狀態(tài)，肝、鰓組織中代謝酶活力評估大菱鲆對高養(yǎng)殖密度脅迫的生理響應。滲透壓數(shù)據(jù)顯示:高養(yǎng)殖密度顯著提高了血液中氯離子(C1-)和滲透壓水平(P＜0.05);同時鰓組織中Na+-K+ ATP酶活力及基因表達也顯著升高(P＜0.05);但對鈉離子(N

7、a+)和鉀離子(K+)濃度沒有影響?？寡趸瘏?shù)顯示:養(yǎng)殖120天后，大菱鲆血漿、鰓、皮膚和肝臟中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)水平在高密度組顯著降低(P＜0.05)，丙二醛(MDA)含量顯著升高（P＜0.05）。代謝參數(shù)顯示:在肝組織中，甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PHD)和果糖-6-磷酸脫氫酶（G6PHD）在高密度組中顯著降低（P＜0.05），但果糖-1，6-二磷酸酶(FBP

8、ase)和己糖激酶(HK)未受養(yǎng)殖密度的影響;在鰓組織中，四種代謝酶均未受養(yǎng)殖密度的影響。以上結(jié)果表明高養(yǎng)殖密度改變了大菱鲆滲透壓水平、引起氧化應激并影響肝臟中脂肪和糖代謝能力。
　　3.循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖密度對大菱鲆應激反應與免疫能力的影響
　　通過檢測血液、粘液、肝、腎和皮膚中應激與免疫相關(guān)蛋白含量以及基因表達評估養(yǎng)殖密度對大菱鲆應激反應與免疫能力的影響。結(jié)果顯示:養(yǎng)殖120天后，血漿中，高密度引起皮質(zhì)醇含量顯著升高，免疫

9、球蛋白M(IgM)、補體3(C3)和溶菌酶(LZM)降低(P＜0.05);粘液中，LZM、堿性磷酸酶(ALP)和酯酶活力在高密度組顯著降低(P＜0.05)?；虮磉_分析顯示:高密度引起肝、腎和皮膚中的熱休克蛋白70(HSP70)、金屬硫蛋白(MT)和細胞色素酶P450(CYP1A)基因表達上調(diào)（P＜0.05）;LZM、鐵調(diào)素(HAMP)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素(IL-1β)基因表達下調(diào)(P＜0

10、.05)。以上結(jié)果顯示過高養(yǎng)殖密度引起了細胞內(nèi)應激反應，同時降低了機體免疫能力。
　　4.大菱鲆對亞硝酸鹽脅迫的應激響應
　　從生理指標、氧化應激、凋亡、免疫等方面評估大菱鲆對亞硝酸鹽脅迫的響應機制。血液生理數(shù)據(jù)顯示:高濃度的亞硝酸鹽(0.4和0.8 mM)暴露48 h后，高鐵血紅蛋白(MetHb)，甘油三酯(TG)、K+、皮質(zhì)醇、HSP70、葡萄糖、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、ALP、C3和C4顯著升高(P

11、＜0.05);而Hb、Na+、IgM、LZM顯著降低(P＜0.05)。鰓組織數(shù)據(jù)顯示:暴露48 h或96 h后，高濃度的亞硝酸鹽顯著降低了抗氧化物酶(SOD、谷胱甘肽氧化酶GPx、CAT)活力，消耗了GSH含量（P＜0.05），促進了MDA形成（P＜0.05）;上調(diào)了凋亡相關(guān)基因(c-jun氨基末端激酶JUK1、p53、caspase-3、caspase-7和caspase-9)、應激與炎癥相關(guān)基因(HSP70、HSP90、MT、Tol

12、l樣受體TLR-3、TNF-α和IL-1β)（P＜0.05）的表達;下調(diào)了LZM和類胰島素生長因子(IGF-1)基因表達(P＜0.05)。結(jié)果表明高濃度亞硝酸鹽擾亂大菱鲆生理功能、誘導氧化應激和脂質(zhì)過氧化、引起細胞內(nèi)應激反應、介導TLR-3表達導致炎癥反應和免疫力降低;同時還誘導鰓組織中細胞凋亡的發(fā)生。
　　5.大菱鲆對氨氮脅迫的應激響應
　　本研究評估了氨氮急性脅迫對大菱鲆生理應激反應、抗氧化狀態(tài)與免疫能力的影響。結(jié)果顯示

13、:高濃度的氨氮(TAN)暴露48 h后，血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇含量顯著升高(P＜0.05)，生長激素(GH)、C3、C4、IgM和LZM含量顯著下降（P＜0.05）;肝臟中SOD和CAT活力、MDA形成、HSP70和HSP90基因表達顯著升高(P＜0.05)，但IGF-1基因表達顯著下降(P＜0.05)。以上結(jié)果表明高濃度氨氮暴露激活HPI軸、誘導氧化應激、抑制GH/IGF-1軸和