禾谷孢囊線蟲雙重PCR檢測體系的建立及SSR標(biāo)記的開發(fā).pdf

1、禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)和菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)是我國麥類作物的重要病原線蟲，可造成小麥產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失。H.avenae在我國16個省市區(qū)的麥區(qū)有發(fā)生分布，而H.filipjevi目前在河南和安徽兩省有分布，此外，二者在河南省復(fù)合侵柒小麥的現(xiàn)象比較普遍。本研究建立同步快速檢測這兩種孢囊線蟲的雙重PCR體系，旨在為我國小麥孢囊線蟲(CCN)的田間快速診斷與綜合治理提供技術(shù)支持;此外，通過挖掘Ge

2、nBank中EST數(shù)據(jù)信息開發(fā)H.avenae的微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記引物，旨在為揭示我國CCN不同地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性以及種群擴(kuò)散傳播途徑提供理論支持。主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于mtDNA-COI序列建立H.avenae和H.filipjevi的雙重PCR檢測體系
　　通過比對分析10種植物寄生線蟲24個群體的mtDNA-COI序列，設(shè)計并篩選出H.avenae特異性上游引物HaF8和H.filipjevi特異性

3、上游引物HfF9，以及二者的下游通用引物HafR8。引物對HaF8/HafR8對H.avenae的擴(kuò)增產(chǎn)物為200bp，而HfF9/HafR8對H.filipjevi的擴(kuò)增產(chǎn)物為320 bp，條帶區(qū)分明顯。
　　建立了針對兩種CCN的雙重PCR檢測體系，在優(yōu)化的退火溫度58℃和引物HaF8/HfF9/HafR8濃度比0.24∶0.16∶0.4μmol/L時，能從不同供試線蟲中同時特異檢測出H.avenae和H.filipjevi，

4、擴(kuò)增效率較高;對H.avenae和H.filipjevi單孢囊的檢測靈敏度為1/2000000個孢囊，而對2齡幼蟲的檢測靈敏度則分別為1/640條線蟲和1/1280條線蟲。對我國黃淮麥區(qū)14個CCN樣本的鑒定結(jié)果表明，該檢測體系可用于H.avenae和H.filipjevi田間單一或混合發(fā)生樣本的同步快速檢測。
　　2.基于EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)H.avenae的SSR標(biāo)記
　　通過挖掘GenBank中EST數(shù)據(jù)信息開發(fā)微衛(wèi)星(S

5、SR)標(biāo)記引物是最為經(jīng)濟(jì)高效的策略。本研究基于H.avenae的EST序列設(shè)計了210對SSR標(biāo)記引物，通過降落PCR和短串聯(lián)重復(fù)(STR)分型檢測，共篩選到13對多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記引物。
　　利用H.avenae群體JSPX對這13對SSR引物進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)CS-31、CS-60、CS-102、CS-121、C8-137、CS-179、CS-187和CS-8384等8對SSR標(biāo)記引物所對應(yīng)的微衛(wèi)星位點，無效等位基因頻率