內(nèi)分泌與代謝病的免疫學(xué)發(fā)病機制研究——CD8+T細胞在1型糖尿病發(fā)病中的作用—散發(fā)性甲旁減自身免疫發(fā)病機制的研究.pdf

1、目的：本研究旨在探討CD8+T細胞是否啟動了胰島炎，如果是，CD8+T細胞是怎樣啟動糖尿病發(fā)生的。 方法：用NOD鼠和基因工程構(gòu)建的NOD背景的轉(zhuǎn)基因鼠作為本研究的動物模型，用PCR和流式細胞技術(shù)鑒定實驗動物的基因型。 結(jié)果： 1.14天齡NOD鼠的脾細胞被轉(zhuǎn)移給6～8周齡的NOD.scid鼠和年齡匹配的NOD.scid.Rip.B7鼠，在轉(zhuǎn)移脾細胞后9周，當(dāng)68.6％NOD.scid.Rip.B7受鼠發(fā)生糖尿病時

2、，NOD.sicd受鼠組尚沒有檢測到胰島淋巴細胞浸潤。轉(zhuǎn)移脾細胞后11周，80％的NOD.scid.Rip.B7鼠發(fā)生糖尿病(圖13 B所示)。但在NOD.sod受鼠組，即使轉(zhuǎn)移后20周，尚沒有1例受鼠發(fā)生糖尿病。 2.我們將相同數(shù)量的、不同周齡的NOD鼠的脾細胞分別轉(zhuǎn)移給相同周齡的NOD.sicd受鼠，觀察T細胞的致糖尿病能力在不同周齡NOD供鼠的變化。 3.從已發(fā)生糖尿病的NOD鼠分離脾細胞并注射給新生的(n=30)

3、以及1周齡，2周齡(n=34)，3周齡(n=32)，6周齡(n=36)的NOD.sicd鼠。所有年齡組的受鼠均在接受轉(zhuǎn)移細胞后5周左右開始發(fā)病，轉(zhuǎn)移后9周時所有年齡組受鼠100％發(fā)病。盡管受鼠的年齡不同，但它們發(fā)生糖尿病的時間卻相似(圖13A)。經(jīng)行×列表資料的x2檢驗，P＞0.05，說明在轉(zhuǎn)移后同一時間，不同周齡的受鼠糖尿病發(fā)病率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 4.從9～10天齡的BDC2.5/NOD.scid鼠的脾臟分離出BDC2.5

4、 CD4+T細胞，將5×105個CD4+T細胞轉(zhuǎn)移給6～8周齡的NOD.scid鼠(n=40)和NOD.scid.Rip.B7鼠(n=40)。兩組受鼠都是從轉(zhuǎn)移后12天開始發(fā)病，到轉(zhuǎn)移后15天時，兩組受鼠糖尿病發(fā)病率均為100％(圖18A)，經(jīng)x2檢驗，兩組受鼠糖尿病發(fā)病率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 5.從4周齡的NOD.Ragnull.AI4 TCR轉(zhuǎn)基因鼠分離脾細胞作為活化的CD8 T細胞，將相當(dāng)于7×105個CD

5、8+T細胞的脾細胞轉(zhuǎn)移至NOD.scid(n=35)或NOD.scid.Rip.B7(n=40)鼠(表3)。雖然兩組受鼠均發(fā)生糖尿病，但發(fā)病速度明顯不同，轉(zhuǎn)移后24天，當(dāng)NOD.sicd.Rip.B7組受鼠全部發(fā)生糖尿病時(發(fā)病率100％)，NOD.Scid對照組糖尿病發(fā)病率只有14.3％，經(jīng)x2檢驗，兩組發(fā)病率有顯著性差異(P＜0.001)。轉(zhuǎn)移相當(dāng)于7×104個CD8+T細胞的脾細胞時，轉(zhuǎn)移后45天，NOD.scid.Rip.B7組

6、受鼠全部(n=40)發(fā)生糖尿病時(表4)，NOD.scid對照組(n=35)糖尿病發(fā)病率只有17.1％，經(jīng)x2檢驗，兩組發(fā)病率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。 6.將9～10天齡NOD.Ragnull.AI4 TCR轉(zhuǎn)基因鼠的靜止的AI4 CD8+T細胞轉(zhuǎn)移到NOD.scid.β2mnull.Rip.B7鼠和NOD.scid.Rip.B7鼠各40只。NOD.scid.Rip.B7組被迅速誘發(fā)糖尿病(圖21所示)，在轉(zhuǎn)移后2

7、3天開始有受鼠發(fā)生糖尿病，轉(zhuǎn)移后35天100％受鼠發(fā)生糖尿病。但作為對照，NOD.scid.β2mnull.Rip.B7組即使在轉(zhuǎn)移后80天也無1例受鼠發(fā)生糖尿病。 7.將CFSE標(biāo)記的對流感病毒血球凝集素(HA)特異性的CL4 CD8+T細胞轉(zhuǎn)移到12只選擇性地在β細胞上表達HA基因的NOD.sicd.ins.HA鼠內(nèi)，1×107CL4 CD8+T細胞/受鼠，12只NOD.scid.鼠作為對照。 結(jié)論： 1.在

8、胰島炎啟動前，新生的和幼年的NOD.scid鼠就已經(jīng)表達與疾病有關(guān)的β細胞自身抗原。 2.β細胞上表達共刺激分子CD80對BDC2.5 CD4+T細胞的致糖尿病能力無影響。 3.CD8+T細胞與β細胞是直接作用的，而NOD.scid受鼠胰島炎的低發(fā)生率提示共刺激分子CD80在胰島淋巴細胞浸潤過程中對靜止的CD8+T細胞發(fā)揮了協(xié)同刺激作用。 4.未被免疫的靜止CD8+T細胞是直接進入胰島，在胰島內(nèi)與內(nèi)源性自身抗原相

9、遇并啟動胰島炎，隨后CD8+T細胞在胰島內(nèi)增殖和擴增。 本研究的創(chuàng)新點1.關(guān)于CD8+ T細胞在1型糖尿病中的作用及其作用方式的研究，國內(nèi)至今尚未見有報道；國外雖然有這方面的研究，但尚無定論。本研究利用過繼轉(zhuǎn)移的方法，研究發(fā)現(xiàn)CD8 T細胞通過與胰島β細胞直接作用，啟動了糖尿病的發(fā)生，目前國內(nèi)外未見報道。 2.利用過繼轉(zhuǎn)移實驗，發(fā)現(xiàn)在糖尿病發(fā)病過程中，共刺激分子對靜止CD8 T細胞的活化依賴于β細胞上表達MHC I類分子

10、。對此國內(nèi)尚未見報道。 3.通過CFSE標(biāo)記靜止的CD8 T細胞，首次發(fā)現(xiàn)CD8 T細胞是直接進入胰島，在胰島內(nèi)被活化，而不是在胰腺淋巴結(jié)等胰腺外的淋巴器官被活化。 本研究采用間接免疫熒光技術(shù)，檢測了26例SIH患者血清中的抗甲狀旁腺自身抗體，從體液免疫方面探討SIH的自身免疫性。運用流式細胞技術(shù)，分析了10例SIH患者外周血淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞的表達，從細胞免疫方面探討SIH的自身免疫性。 方法：

11、 1、研究對象：散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者26例及其直系親屬112例和健康對照60例。 2、抗甲狀旁腺抗體的檢測：采用間接免疫熒光技術(shù)，選用猴子甲狀旁腺作底物抗原，用DAPI染核定位甲狀旁腺細胞。結(jié)果先在熒光顯微鏡下觀察，抗體滴度1:10陽性者，再按1:100稀釋重復(fù)上述步驟。然后用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)進行掃描并采集圖像。488nm波長的光激發(fā)綠色熒光圖像(FITC標(biāo)記的抗體)、356nm波長的光(紫外光，UV)激發(fā)藍色熒

12、光圖像(DAPI標(biāo)記的細胞核)。 3、血清鈣、血清磷和血清鎂含量檢測：分別用偶氮砷III法、紫外直接沉淀法和二甲苯胺藍比色法。 4、血清FT3、FT4、TSH、Cortisol、TPOAb檢測：采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法，iPTH用雙抗體夾心法。 5、外周血淋巴細胞亞群的分析：從ACD抗凝的新鮮外周血分離單個核細胞，用熒光標(biāo)記的抗體染色，洗滌去除未結(jié)合的抗體后，應(yīng)用流式細胞儀進行檢測。 6、流式細胞分析：用

13、Becton Dickinson FACScalibur流式細胞儀檢測，激發(fā)光為氬離子激光488nm譜線，使用熒光校準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器，調(diào)整各熒光補償。首先檢測對照管，建立二維散點圖，在散點圖上調(diào)整參數(shù)前向散射光(FSC)及側(cè)向散射光(SSC)，調(diào)整閾值，圈定淋巴細胞射門以獲取細胞。 結(jié)果： 1、一般指標(biāo)治療前26例患者血清鈣與iPTH水平均明顯降低，與直系親屬組及正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均小于0.01)，血清磷水

14、平明顯升高，與直系親屬組及正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均小于0.05)，以上各指標(biāo)在直系親屬組與正常對照組之間無顯著性差異(P均大于0.05)。3組血清鎂比較雖然無顯著性差異，但其中4例SIH患者血清鎂略低于正常范圍；3組FT3，F(xiàn)T4，TSH，Cortisol及TPOAb等均在正常范圍，統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(P均大于0.05)。 2、抗甲狀旁腺抗體 26例SIH患者中有10例(8例為女性)患者的血清1:10稀釋時抗甲

15、狀旁腺抗體陽性，陽性率38.46％，其中3例在1:100稀釋時仍呈陽性反應(yīng)。112例患者直系親屬中有11例血清1:10稀釋時抗甲狀旁腺抗體陽性，陽性率9.82％，60例正常對照組中有4例血清1:10稀釋時抗甲狀旁腺抗體呈陽性反應(yīng)，陽性率6.67％，SIH患者組陽性率明顯高于直系親屬組與正常對照組(P均小于0.01)，直系親屬組與正常對照組抗體陽性率無顯著性差異(P＞0.05)?？贵w陽性的患者與抗體陰性的患者血清鈣、磷、鎂水平無顯著性差異

16、(P均大于0.05)。兩組性別、年齡構(gòu)成無顯著性差異，病程及血清iPTH水平比較差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但抗體陰性的患者病程較抗體陽性的患者有延長的趨勢，并且其血清iPTH水平較陽性組患者有降低的趨勢。 3、淋巴細胞表型的檢測所測的淋巴細胞亞群中，CD4+，CD8+，CD4+比CD8+比值，CD5+，CD19+，CD5+CD19+等在三組研究對象間結(jié)果相似，三組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SIH患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細

17、胞的百分率較健康對照組及患者直系親屬組低，二者比較有顯著性差異(P＜0.01)，患者直系親屬組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的百分率與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論： 散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者體內(nèi)自身反應(yīng)性抗體的存在以及CD4+CD25+Treg細胞的改變，表明其自身免疫功能的紊亂。 本研究的創(chuàng)新點： 1、首次對散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞的表達進行了研

18、究，從細胞免疫學(xué)角度探討疾病的自身免疫發(fā)病機制，檢索近20年的文獻，國內(nèi)外未見任何報道。 2、首次利用流式細胞技術(shù)，探討了散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者外周血中單個核細胞淋巴細胞亞群的表達，檢索近20年的文獻，國外只有1篇關(guān)于特發(fā)性甲旁減淋巴細胞亞群的研究報道。 3、利用間接免疫熒光技術(shù)，對散發(fā)性特發(fā)甲旁減患者體內(nèi)抗甲狀旁腺自身抗體的存在進行了研究，從體液免疫角度探討疾病的自身免疫發(fā)病機制，至今國內(nèi)未見任何報道，國外的研究也很少。