周期性牽張力對(duì)鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性及RANKL、M-CSF蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、背景成骨/基質(zhì)細(xì)胞合成、分泌的轉(zhuǎn)錄因子NF-KB受體活化劑配體(receptoractivatorofNF-KBligand，RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor，M-CSF)在促進(jìn)破骨細(xì)胞生成過程中是必需的。RANKL主要表達(dá)在成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及胸腺、淋巴結(jié)和脾組織中，能促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟和活化。M-CSF是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和破骨細(xì)胞的一種生長因子，主要

2、通過促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的募集和分化發(fā)揮作用。RANKL及M-CSF均以兩種分子形式存在：分泌型(sRANKL、sM-CSF)和膜型(mRANKL、mM-CSF)。 機(jī)械應(yīng)變是調(diào)控RANKL和M-CSF合成和分泌變化的一種重要的刺激因素。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是一種力學(xué)可興奮細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，一定范圍的機(jī)械力可以影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞的RANKL和M-CSF表達(dá)，且表達(dá)的量與機(jī)械刺激的大小、頻率、作用時(shí)間緊密相聯(lián)。低水平的機(jī)械張力(0-250

3、strain)不足以維持骨形成，機(jī)械張力在250-2500μstrain時(shí)可為骨組織的維持提供有效的生理性的刺激。當(dāng)張力超過2500μstrain時(shí)，骨組織的破壞速度大大加快，被認(rèn)為是病理性刺激。目前的文獻(xiàn)研究局限于一定大小機(jī)械刺激影響各種骨組織細(xì)胞的蛋白合成，且力值偏大，而機(jī)械牽張力細(xì)分為生理性和病理性，以及在蛋白水平應(yīng)力如何分別調(diào)控sRANKL、mRANKL、sM-CSF、mM-CSF的表達(dá)尚未明確。 研究目的1.本實(shí)驗(yàn)通過

4、一種先進(jìn)的體外細(xì)胞拉伸加力裝置，對(duì)鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2施加生理性及病理性周期牽張力，觀察細(xì)胞受力前后細(xì)胞形態(tài)及增殖活性的變化。 2.對(duì)鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2分別施加生理性及病理性的周期性牽張力，觀察分泌型及膜型RANKL和M-CSF蛋白的表達(dá)變化。 材料和方法1.體外細(xì)胞加力裝置及力學(xué)刺激 細(xì)胞加力采用華中電子科技大學(xué)研制的四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀。將ST2接種到特制的塑料培養(yǎng)板上，繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)板上的細(xì)胞

5、生長到80％匯合，將培養(yǎng)板放入加力皿內(nèi)，在加力裝置上進(jìn)行加力。細(xì)胞所受的張力大小由彈性板的彎曲位移(mm)表示，位移越大，形變越大，表示細(xì)胞受牽張力越大。本實(shí)驗(yàn)加力頻率固定為0.5Hz，位移為1mm和2mm，即張力為1785μstrain及3570μstrain。 2.MTT法測定機(jī)械力對(duì)ST2細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞在特制的培養(yǎng)板上生長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，隨機(jī)分為3組，第1組靜置不加力，第2組加力位移1mm，第3組加力位移2m

6、m，加力時(shí)間6h。加力后細(xì)胞以2×104的密度接種于96孔板，每組接種21孔，每孔加200ul完全培養(yǎng)基。以只加完全培養(yǎng)液的孔作為空白對(duì)照組。每24h各組測定3個(gè)孔，每孔加入20ulMTT溶液(5g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3h，吸去培養(yǎng)液，加入200ulDMSO，振蕩10min，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上以570nm測定光吸收值A(chǔ)570。 3.ELISA檢測機(jī)械力刺激下細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌型RANKL、M-CSF的含量細(xì)胞在特制的培養(yǎng)板上生長到對(duì)數(shù)

7、生長期時(shí)，隨機(jī)分為2組，第1組加力位移1mm，第2組加力位移2mm，加力時(shí)間12h。加力過程中，分別在0h、0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h等8個(gè)時(shí)間點(diǎn)從加力皿中各取200ul培養(yǎng)液樣品，按ELISA試劑盒的要求進(jìn)行檢測。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上以450nm測定光吸收值A(chǔ)450。 4.免疫沉淀westernblot檢測機(jī)械力刺激下膜型RANKL、M-CSF含量細(xì)胞隨機(jī)分成6組，各組的加力時(shí)間分別為0h、1h、3h、6h、

8、9h、12h，除對(duì)照組，其他各時(shí)間組以位移1mm及2mm分別進(jìn)行力學(xué)加載并各自重復(fù)3次。加力后的細(xì)胞每塊塑料板加100uL的裂解液冰浴裂解。20min后，13000r/min、4℃離心10min，取上清分裝備用。每份樣品取2uL用作Bradford法做蛋白定量。每份樣品取200ug加入1uL的RANKL抗體，4℃靜置1h，后加入免疫沉淀IgG抗體200uL，4℃搖晃混旋過夜，PBS2500g離心清洗取沉淀。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電

9、泳、轉(zhuǎn)膜、一抗二抗反應(yīng)后曝光，膠片掃描后用光密度分析軟件測定蛋白質(zhì)條帶光密度值。 結(jié)果1.MTT結(jié)果：對(duì)照組的細(xì)胞增殖穩(wěn)定，細(xì)胞數(shù)量明顯較多，1mm加力組與對(duì)照組無差異，2mm加力組細(xì)胞增殖緩慢(P＜0.01)。 2.ELISA結(jié)果：1mm牽張力作用下，細(xì)胞表達(dá)sRANKL、sM-CSF蛋白表達(dá)組間無差異，2mm牽張力作用下，sRANKL表達(dá)從3h開始表達(dá)增多(P＜0.05)，12h時(shí)差異顯著(P＜0.01)。sM-CS

10、F蛋白的表達(dá)從0.5h開始上升(P＜0.05)，從9h開始顯著高于對(duì)照(P＜0.01)。 3.免疫沉淀westernblot結(jié)果：1mm牽張力作用下，6h開始mRANKL蛋白隨著時(shí)間表達(dá)減少(P＜0.05)，mM-CSF無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2mm的牽張力作用下，mRANKL、mM-CSF皆無顯著差異。 結(jié)論1.細(xì)胞受病理性牽張力后功能狀態(tài)發(fā)生變化，生長增殖受到抑制。2.生理性牽張力抑制mRANKL的表達(dá)，病理性的牽張力則促進(jìn)s