解偶聯(lián)蛋白（UCPs）與肥胖關(guān)系研究及UCP4基因在脂肪細(xì)胞中的功能探討.pdf

1、肥胖是常見(jiàn)的能量代謝性疾病，是引起糖尿病、高血壓、心腦血管等多種疾病的危險(xiǎn)因素。肥胖發(fā)生率正逐年增高，并成為全球性的流行性疾病。近年來(lái)，肥胖低齡化的趨勢(shì)日趨突出，兒童與青少年肥胖問(wèn)題受到廣泛關(guān)注，探討肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制已成為兒科學(xué)的重要研究方向之一。 隨遺傳易感性決定肥胖發(fā)生發(fā)展的理論獲得普遍共識(shí)，近年來(lái)開(kāi)展肥胖病因的遺傳學(xué)研究倍受重視，迄今為止已發(fā)現(xiàn)有兩百多個(gè)基因及多個(gè)染色體區(qū)域與肥胖相關(guān)。已知，解偶聯(lián)蛋白家族(Unco

2、uplingProteins，UCPs)是一類位于線粒體內(nèi)膜上的基因，由于其功能預(yù)測(cè)可能參與能量代謝，因此其與肥胖發(fā)生發(fā)展的關(guān)系引起關(guān)注。解偶聯(lián)蛋白家族有5個(gè)亞型，其中UCP1、UCP2、UCP3三個(gè)亞型與肥胖之間的關(guān)系已有較多研究，但有關(guān)UCP4、UCP5亞型與肥胖關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以UCP4基因?yàn)檠芯壳腥朦c(diǎn)，旨在闡明UCPs的多組織表達(dá)特征及UCPs在脂肪細(xì)胞中的功能。 為揭示UCPs基因的多組織表達(dá)特征，本文第一部

3、分分別以飲食誘導(dǎo)性肥胖大鼠、遺傳性肥胖小鼠兩種模型為研究對(duì)象，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5基因在嚙齒類肥胖動(dòng)物白色脂肪、棕色脂肪、腦、骨骼肌、肝臟組織中的：mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是飲食誘導(dǎo)性肥胖模型還是遺傳性肥胖模型，UCPs基因在白色脂肪、棕色脂肪、骨骼肌、肝臟、腦組織中的表達(dá)均有顯著變化；其中，UP4基因在兩種模型中除表達(dá)于腦組織外，腹膜后脂肪、骨骼肌、肝臟等組織中均有表達(dá)，且呈現(xiàn)在

4、飲食性肥胖大鼠腹膜后脂肪組織中表達(dá)顯著下調(diào)的特征，而在遺傳性肥胖小鼠僅腦組織中表達(dá)有顯著變化，從而探討了UPs的多組織表達(dá)，并證實(shí)UCP4基因不僅在腦組織中有表達(dá)而且也存在于脂肪組織中，于飲食誘導(dǎo)性肥胖大鼠、遺傳性肥胖小鼠兩種模型具有不同的多組織表達(dá)特征。其中，UCP4基因在飲食性肥胖大鼠腹膜后脂肪組織中表達(dá)顯著下調(diào)的研究結(jié)果，為深入開(kāi)展該基因在脂肪組織中的功能研究提供了理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，本文第二部分進(jìn)一步以3T3-L1脂肪細(xì)胞為研

5、究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建UCP4基因表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染3T3-L1前體脂肪細(xì)胞株，觀察UCP4基因過(guò)表達(dá)對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖、凋亡、分化、脂質(zhì)形成及葡萄糖攝取功能的影響，初步探討UCP4在脂肪細(xì)胞中的功能，以分析該基因與肥胖發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 以MDI方案誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞3T3-L1向成熟脂肪分化，應(yīng)用油紅O染色脂滴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UCP4基因過(guò)表達(dá)可顯著抑制3T3-L1細(xì)胞的分化，與對(duì)照相比，脂滴不但出現(xiàn)晚，而且在分化的同一時(shí)間點(diǎn)其細(xì)胞內(nèi)的脂

6、滴也較小。進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中脂肪細(xì)胞的標(biāo)志基因(C/EBPα、PPAR Y、LPL、AP2、FAS)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCP4基因過(guò)表達(dá)可顯著抑制脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)程，3T3-L1細(xì)胞中上述標(biāo)志基因均表達(dá)下調(diào)。 已知在正常脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程中，于誘導(dǎo)分化第八天約95％脂肪細(xì)胞成為成熟的脂肪細(xì)胞。為觀察UCP4基因過(guò)表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積聚的影響，本文進(jìn)一步收集誘導(dǎo)分化第8天的脂肪細(xì)胞，并測(cè)定胞內(nèi)甘油三酯含量，結(jié)

7、果發(fā)現(xiàn)UCP4基因過(guò)表達(dá)可顯著降低3T3-L1脂肪細(xì)胞中甘油三酯的含量，提示UCP4基因具有影響脂質(zhì)積聚的功能。采用MTT法檢測(cè)脂肪細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCP4基因過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖，與對(duì)照相比，UCP4基因過(guò)表達(dá)可顯著增加S期3T3-L1脂肪細(xì)胞數(shù)，提示UCP4基因還具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等功能。 以血清饑餓誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞凋亡，并應(yīng)用Annexin V-FITC

8、方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCP4基因過(guò)表達(dá)可顯著抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的凋亡，其細(xì)胞凋亡率較對(duì)照明顯減少，提示UCP4基因?qū)?T3-L1的細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。 進(jìn)一步應(yīng)用<'3>H標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖(2-Deoxy．glucose)檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCP4基因過(guò)表達(dá)可顯著降低成熟脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率，其脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖攝取率、胰島素刺激后的葡萄糖攝取率較對(duì)照均顯著降低。更進(jìn)一步采用RT-PCR

9、技術(shù)檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞中的GLUT1、GLUT4基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCP4基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的3T3-L1脂肪細(xì)胞株中GLUT1、GLUT4基因的表達(dá)較對(duì)照均明顯下調(diào)，提示UCP4基因可能通過(guò)影響GLUTs基因的表達(dá)而改變脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率，UCP4基因還具有影響胰島素敏感性的功能。 本研究的創(chuàng)新之處在于：(1)本研究首次應(yīng)用兩種肥胖動(dòng)物模型(飲食誘導(dǎo)、遺傳)，在整體水平上揭示了UCPs家族各個(gè)成員的多組織表達(dá)特征；(2)再次證實(shí)U

10、CP4基因除表達(dá)于腦組織外，腹膜后脂肪、骨骼肌、肝臟等組織中均有表達(dá)，并首次發(fā)現(xiàn)UCP4基因在飲食性肥胖大鼠腹膜后脂肪組織中呈現(xiàn)表達(dá)顯著下調(diào)的特征，而在遺傳性肥胖小鼠中僅腦組織表達(dá)有顯著變化；(3)針對(duì)UCP4在脂肪細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究，首次發(fā)現(xiàn)UCP4基因能夠抑制脂肪細(xì)胞分化、抑制脂質(zhì)積聚，首次發(fā)現(xiàn)UCP4基因具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖、抑制脂肪細(xì)胞凋亡的作用，首次發(fā)現(xiàn)UCP4基因還具有抑制成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的功能。從而為UCP4基因作