人類腸道病毒B組山東株優(yōu)勢血清型基因重組和進化起源的分子流行病學研究.pdf

1、[背景]
　　 人類腸道病毒(HEV)隸屬于小核糖核酸（Ribonucleic Acid, RNA）病毒目（Picornavirales）小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus），基因組為單股正鏈RNA。病毒基因組的5'非編碼區(qū)含有基因組RNA復制和翻譯所需的結構，3'非編碼區(qū)具有與基因組復制有關的高度保守的二級機構及多聚腺苷酸(polyA)尾。編碼區(qū)分為結構蛋白編碼區(qū)(P1)和非結構蛋

2、白編碼區(qū)(P2和P3)。結構蛋白編碼區(qū)(P1)依次編碼VP4、VP2、VP3和VP1共4個衣殼結構蛋白。其中VP1蛋白位于病毒顆粒最外側，含有主要的抗原位點，是進行基因分型和分子流行病學研究最主要的靶基因。
　　 根據VP1序列核苷酸差異，HEV分為HEVA組（HEV-A）、B組(HEV-B)、C組(HEV-C)和D組(HEV-D)4個組。目前，HEV-B包含59個血清型，為4個組中所含血清型最多的一組。HEV-B病毒不僅血清型

3、別眾多，而且流行范圍廣泛，可導致多種疾病的暴發(fā)流行，加之HEV基因組變異迅速，新的血清型不斷出現，因而HEV-B血清型病毒成為當前研究關注的熱點之一。
　　 早在50多年前，人們就發(fā)現RNA病毒間復雜的基因變異。近些年的研究發(fā)現，在全球多個脊髓灰質炎（以下簡稱脊灰）病毒(PV)減毒活疫苗免疫覆蓋率低的地區(qū)，多次出現由重組后的脊灰疫苗衍生株病毒循環(huán)(cVDPVs)導致的脊灰暴發(fā)，使消滅脊灰的免疫策略及疾病監(jiān)測變得更為復雜，也引起人

4、們對HEV遺傳變異機制的研究產生了新的興趣，更加關注HEV基因組的易變性，為研究HEV的進化提供了新的視點。
　　 HEV基因組的進化方式包括核苷酸點突變和遺傳重組。P1編碼區(qū)的進化幾乎均由核苷酸替換所引起的點突變驅動的。P2和P3區(qū)編碼病毒復制所需的非結構蛋白和酶，這些多肽蛋白序列的相對保守，功能相對穩(wěn)定，而大多數點突變對于蛋白和酶的功能來說是不利的，基因重組成為其進化的主要手段。HEV的進化就是基因組的各個部分在以不同方式進

5、化的同時，通過遺傳重組而產生出的被自然選擇的優(yōu)勢毒株的過程。由于3D編碼區(qū)位于基因組的3'末端，故比較VP1和3D基因在系統(tǒng)發(fā)生上的差異，可作為篩選重組發(fā)生的指標。
　　 在過去20多年里，山東省從急性弛緩性麻痹(AFP)、無菌性腦膜炎(AM)2種疾病監(jiān)測病例分離到上千株HEV山東株，其中多數屬于HEV-B，且有些HEV-B血清型呈現為優(yōu)勢血清型。HEV感染已成為嚴重威脅廣大人群特別是兒童身體健康與生命安全的重大公共衛(wèi)生問題之一

6、。因此，運用分子流行病學的方法，通過對HEV-B優(yōu)勢血清型山東株基因序列的分析，探索HEV-B在區(qū)域性引入和擴散過程中VP1進化遺傳學和居群動力學特征，分析不同血清型間重組在HEV進化中的發(fā)生頻率，對于HEV所致相關疾病的機制及其預防控制均具有重要的理論和實際意義。
　　 [研究目的]
　　 1.構建并完善HEV-B山東株優(yōu)勢血清型(CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、Echo7、Echo11、Echo14、Ech

7、o19、Echo25、Echo30)的VP1區(qū)和3D區(qū)基因數據庫，并對其進行基因特征研究。
　　 2.探討HEV-B山東株優(yōu)勢血清型基因重組的發(fā)生，闡明各主要血清型在山東省共循環(huán)過程中的基因重組規(guī)律及重組基因片段的轉移方向和頻率。
　　 3.分析HEV-B山東株優(yōu)勢血清型的基因序列起源、進化速度及流行史重構等進化起源特征。
　　 [研究方法]
　　 1.毒株來源:本研究所選毒株來自山東省1989～2010

8、年AFP和AM2種疾病監(jiān)測病例。實驗前接種RD或Hep-2細胞進行病毒增殖。
　　 2.基因測序:提取病毒RNA，RT-PCR擴增VP1和3D區(qū)基因片段，經1％瓊脂糖凝膠電泳后對陽性產物進行序列測定。
　　 3.型別鑒定:將各血清型的VP1序列通過NCBI在線提供的BLAST程序與數據庫序列進行比對，確定HEV山東株的血清型別。
　　 4.生物信息學分析:使用Mega4.0軟件，構建VP1區(qū)和3D區(qū)系統(tǒng)進化樹，分

9、析HEV山東株優(yōu)勢血清型基因重組情況。通過BEAST1.6.2軟件分析HEV-B山東株優(yōu)勢血清型的進化遺傳學特征，重構優(yōu)勢血清型毒株在山東省內的流行史。
　　 [主要結果]
　　 1.HEV-B山東株優(yōu)勢血清型的確定:在前期研究中，已通過HEV分子生物學定型方法對部分山東株的血清型別進行鑒定。本研究在前期研究基礎上繼續(xù)對1989～2010年分離自山東省AFP和AM監(jiān)測病例的HEV山東株進行型別鑒定，共鑒別出非脊灰腸道病毒

10、(NPEV)1010株，涵蓋58個HEV血清型別。其中，CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30這10個血清型在山東省歷年HEV檢測中共分離到792株，占所有已定血清型分離株的78.4％(792/1010)，為HEV-B山東株優(yōu)勢血清型別。
　　 2.HEV-B山東株優(yōu)勢血清型基因重組分析:本研究共選取458株HEV-B山東株3D序列進行序列分析。

11、通過構建3D區(qū)系統(tǒng)進化樹發(fā)現，山東省10個優(yōu)勢血清型毒株間在非結構蛋白編碼區(qū)內存在頻繁的基因重組現象，山東株在3D區(qū)系統(tǒng)進化樹中共劃分為13個主要的基因簇。
　　 (1)3D區(qū)系統(tǒng)進化樹顯示，每個基因簇所包含血清型別不盡相同，同一血清型的山東株在3D區(qū)系統(tǒng)進化樹中分處不同的基因簇。每個基因簇的山東分離株歸屬于2～9個HEV血清型，第1、4、6、8、12、13基因簇為優(yōu)勢基因簇。
　　 (2)3D編碼區(qū)不同基因簇的主要分離

12、時間不完全相同。3D區(qū)系統(tǒng)進化樹基因簇的最長分離時間跨度為21年，各基因簇平均優(yōu)勢分離時間跨度約為15（14.8±4.6）年。
　　 3.HEV-B山東株優(yōu)勢血清型進化起源分析:本研究所選10個HEV-B山東優(yōu)勢血清型毒株的祖先約起源于1885～1913年之間，不同血清型VP1區(qū)核苷酸序列每年每個堿基位點的進化速度為1.007×10-3～9.856×10-3。其中，CVA9、Echo6、Echo7、Echo25血清型山東株與來自

13、中國其他省份和世界各地的分離株存在共同的進化祖先，而CVB3、Echo11、Echo14、Echo19、Echo30血清型山東株僅與中國其他省份的相應毒株有共同的祖先起源。
　　 [主要結論]
　　 1.CVA9、 CVB3、 CVB5、 Echo6、 Echo7、 Echo11、 Echo14、 Echo19、 Echo25、Echo30血清型為山東省HEV-B優(yōu)勢血清型。在長達22年的AFP和AM疾病監(jiān)測中，本研究所

14、選10個血清型毒株在山東省歷年分離數明顯高于其他HEV血清型別，并且在山東省局部地區(qū)曾多次引起AM等相關疾病的暴發(fā)流行，為山東省內共循環(huán)毒株的HEV-B優(yōu)勢血清型。
　　 2.基因重組是HEV非結構蛋白區(qū)重要的進化方式。HEV-B山東株在3D進化樹中劃分為13個主要的基因簇，各基因簇中HEV-B血清型種類和數量不同。同一血清型山東株位于多個基因簇，而不同基因簇的主要分離時間不完全相同。提示HEV-B山東株非結構蛋白區(qū)基因片段轉移