P2X7r調控AQP4表達在HBOP機制中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　腦缺血性疾病占腦血管疾病總數(shù)的90％以上,如何提高腦組織對缺氧的耐受,減輕缺血后神經(jīng)及功能損傷,一直是神經(jīng)外科領域研究的難點和重點。本課題前期試驗發(fā)現(xiàn),高壓氧預適應(hyperbaric oxygen preconditioning,HBOP)對脊髓損傷、腦缺血都表現(xiàn)出了積極的保護作用,但其具體作用機制尚不明確。
　　P2X7r(P2X7 receptor)是ATP門控離子通道家族中的獨特亞型,廣泛分布于腦

2、組織細胞,P2X7r作為上游調節(jié)位點,在神經(jīng)系統(tǒng)參與多種功能活動,在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。AQP4是膜水通道蛋白,在血腦屏障(blood brain barrier, BBB)的星形膠質細胞足突高度表達,是星形膠質細胞上最為主要的功能蛋白,與水分子的轉運密切相關。AQP4的調控影響著BBB的通透性變化,同樣在缺血缺氧腦水腫的發(fā)生發(fā)展進程中扮演重要角色。
　　課題前期動物實驗部分發(fā)現(xiàn),HBOP能通過下調P2X7r和AQP4蛋白

3、的表達起到對小鼠MCAO模型的保護作用。應用P2X7r的激動劑BzATP在MCAO之前對小鼠進行預處理,能上調AQP4表達,加重實驗動物的神經(jīng)功能損傷。這說明P2X7r對AQP4具有調控作用。因此本課題在前期動物實驗的基礎上,以離體培養(yǎng)的大鼠腦星形膠質細胞為研究對象,探討HBOP對星形膠質細胞(oxygen glucose deprivation)OGD模型的缺氧保護作用,并著重研究P2X7r對AQP4的調控及其在HBOP抗細胞缺氧損傷

4、機制中的重要地位。
　　方法:
　　1.選擇出生3天以內(nèi)的新生大鼠,從大腦中分離星形膠質細胞,通過對傳統(tǒng)培養(yǎng)技術的改進,培養(yǎng)出純度高且能穩(wěn)定傳代的星形膠質細胞,進行免疫熒光染色鑒定。
　　2.傳代后的細胞分為4個組:對照組(control)、高壓氧預適應組(HBOP)、單純?nèi)毖踅M(OGD)、高壓氧預適應缺氧組(HBOP+OGD)。按既定方案進行細胞處理后,分別檢測各組細胞培養(yǎng)基、細胞裂解液的化學發(fā)光度值,細胞凋亡率,并

5、運用Western Blot和QT-PCR技術檢測各組細胞在預定時相點P2X7r及AQP4的蛋白及mRNA表達情況。
　　3.細胞分為8個組:HBOP組、HBOP+BBG組、HBOP+BzATP組、HBOP+BBG+BzATP組、HBOP+OGD組、HBOP+BBG+OGD組、HBOP+BzATP+OGD組、HBOP+BBG+BzATP+OGD組(BzATP和BBG分別為P2X7r的激動劑與拮抗劑)。按既定方案進行細胞處理后,進行

6、細胞凋亡率檢測,并運用Western Blot和 QT-PCR技術檢測各組細胞在預定時相點P2X7r及AQP4的蛋白及mRNA表達情況。
　　結果:
　　1.培養(yǎng)出的星形膠質細胞高度表達GFAP抗體,細胞計數(shù)分析顯示純化度高達95%;
　　2.HBOP具有明確的細胞缺氧保護作用;應用P2X7r的激動劑BzATP可削弱這種保護力度,加重缺氧損傷,BBG可部分拮抗BzATP的負效應;
　　3.HBOP可上調離體培養(yǎng)大

7、鼠腦星形膠質細胞的P2X7r表達,降低AQP4蛋白表達水平;在進行OGD處理后,OGD組細胞的P2X7r和AQP4蛋白表達在缺氧6h即達到高峰,此后變化不大;而HBOP+OGD組細胞的P2X7r和AQP4蛋白表達在缺氧6h下調,此后升高,在缺氧12h時達到高峰,總體呈先降后升的趨勢。QT-PCR結果與Western blot結果基本一致;
　　4.在正常條件下,應用BzATP后,P2X7r表達水平增加,AQP4表達減弱,應用BBG

8、后,P2X7r表達下調,而AQP4的表達增加;在缺氧環(huán)境中,應用BzATP能同時上調P2X7r和AQP4的表達,應用BBG能同時下調P2X7r和AQP4的表達;BzATP的激動劑作用能被BBG部分拮抗。
　　結論:
　　1.HBOP處理能有效降低OGD細胞的凋亡率,具有明確的缺氧保護作用;
　　2.HBOP通過延遲OGD細胞的P2X7r和AQP4蛋白表達高峰起到細胞缺氧保護作用;
　　3.BzATP能拮抗HBOP