新型混合性生物人工肝體外功能和安全性研究.pdf

1、急性肝衰蝎,病情危篤,進(jìn)展迅速,預(yù)后兇險(xiǎn),是臨床亟待解決的治療難題。盡管近年來內(nèi)科綜合治療措施取得了較大進(jìn)展,患者病死率依然高達(dá)50-80％。肝移植可以顯著降低肝衰竭患者病死率,但由于供肝嚴(yán)重短缺,事實(shí)上僅有不足1/3的患者接受了肝移植手術(shù),而大多數(shù)患者在等待供肝的過程中死亡?；诖朔N前提下,國內(nèi)外學(xué)者設(shè)計(jì)、構(gòu)建了不同類型的人工肝系統(tǒng),希冀借助一種體外的機(jī)械、理化或者生物的裝置,清除患者體內(nèi)蓄積的各種有害物質(zhì),補(bǔ)充必需物質(zhì),改善內(nèi)環(huán)境,

2、暫時(shí)替代衰竭肝臟的部分功能,為肝衰竭患者肝細(xì)胞再生及肝功能恢復(fù)創(chuàng)造條件,或等待供肝進(jìn)行肝移植,從而降低患者病亡率。
　　 經(jīng)過50余年的發(fā)展,目前人工肝支持系統(tǒng)(artificial liver support system,ALSS)治療技術(shù)已逐漸成熟,基本形成三大類十幾種方法,國外多數(shù)學(xué)者按照人工肝的組成和性質(zhì)分為以下三類:(1)非生物型人工肝；(2)生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)；(3)混合

3、型生物人工肝(hybrid bioartificial liver,HAL)。其中,HAL 代表著人工肝的發(fā)展方向。
　　 無論是 BAL 還是 HAL,肝細(xì)胞都是其核心原材料,對肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細(xì)胞的生物學(xué)功能。BAL 和HBAL 細(xì)胞來源種類較多,但目前尚未有一種可以完全滿足臨床的需要,如人肝細(xì)胞來源的匾乏、胎肝細(xì)胞的倫理問題、肝細(xì)胞株的瘤源性等因?yàn)?、豬肝細(xì)胞潛在的異種細(xì)胞免疫反應(yīng)、合成的蛋白質(zhì)

4、種屬差異和豬體內(nèi)普遍存在著內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(procineendogenous retroviral,PERV)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),中國人肝細(xì)胞系 CL-1 細(xì)胞分化程度高且生物代謝功能良好,并且 CL-1 細(xì)胞組織學(xué)上來源于正常肝組織,較其他來源于腫瘤源性的肝細(xì)胞系更為安全,但是目前尚未對 CL-1 細(xì)胞作為種子細(xì)胞的BAL 和HAL 進(jìn)行研究。
　　 迄今已有 4 種 BAL 或 HAL 系統(tǒng)業(yè)已開始進(jìn)行Ⅱ-Ⅲ期臨床驗(yàn)證,

5、其中大多采用中空纖維管型生物反應(yīng)器,氧合的血漿流經(jīng)中空纖維內(nèi)腔以供應(yīng)肝細(xì)胞氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。初步結(jié)果證明這些治療是安全、有效的,沒有明顯的不良事件出現(xiàn)。但是,由于血漿攜氧能力不足全血的10％,因此,這些系統(tǒng)的氧供遠(yuǎn)不能滿足肝細(xì)胞的需要,很大部分的肝細(xì)胞可能處于缺氧狀態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞活性降低和肝細(xì)胞功能不良,最終導(dǎo)致這些人工肝系統(tǒng)的療效降低,并且中空纖維反應(yīng)器中肝細(xì)胞分御不均勻,細(xì)胞粘附能力差,膜的污染和堵塞,細(xì)胞生長或過量氣體產(chǎn)生會破壞

6、纖維,既影響細(xì)胞功能的發(fā)揮又影響對生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞功能狀態(tài)的觀察。
　　 為解決生物反應(yīng)器中肝細(xì)胞缺氧問題,我們與中科院共同研制了一種全接觸灌流型生物反應(yīng)器。該反應(yīng)器采用雙進(jìn)口和雙出口的透明有機(jī)塑料制成,并且這種反應(yīng)器在治療時(shí)做180度的往返旋轉(zhuǎn)運(yùn)動,生物反應(yīng)器中的肝細(xì)胞與血漿直接接觸,可以充分的發(fā)揮肝細(xì)胞的代謝和生物轉(zhuǎn)化功能,并且 HAL 系統(tǒng)的生物部分有獨(dú)立的共給氧氣的裝置,氧氣通過膜式氧合器進(jìn)入血清中,供給反應(yīng)器中的肝細(xì)胞

7、,以保證生物反應(yīng)器中的肝細(xì)胞得到充分的氧氣供應(yīng)。
　　 本研究中,我們以這種全接觸灌流型生物反應(yīng)器接種微載體微重力肝細(xì)胞共培養(yǎng)至第五天的CL-1 細(xì)胞,結(jié)合非生物部分的血漿灌流器,生物反應(yīng)箱、蠕動泵、膜式氧合器等構(gòu)建了一種簡單、新穎的HAL,并用模擬肝衰竭血清(專利公開號:CN101556275)對其進(jìn)行療效和安全性評價(jià)。具體包括以下三部分研究內(nèi)容:
　　 一；配置一種可以在常溫下穩(wěn)定保存的、能夠反映部分肝衰竭患者血清成

8、分變化的組合物；
　　 二:混合型生物人工肝的構(gòu)建和評價(jià)；
　　 三:CL-1 細(xì)胞作為種子細(xì)胞安全性的研究。
　　 第一部分 模擬肝衰竭血清的配置及其穩(wěn)定性研究
　　 目的:依據(jù)臨床上肝功能衰竭時(shí)血清成分變化的主要特點(diǎn),研制一種可用于體外檢測混合型生物人工肝支持功能的組合物。
　　 方法:(1)以未結(jié)合膽紅素,鵝去氧膽酸,膽酸和氯化銨為組合物中的主要成分,將其先后溶解胎牛血清濃度為 10％DME

9、M 細(xì)胞培養(yǎng)基中,并使未結(jié)合膽紅素,鵝去氧膽酸,膽酸和氯化銨的濃度分別在 171-342μmol/L、80-160μmol/L、20-40 μmol/L 和240-400μmol/L 范圍內(nèi)；(2)先將未結(jié)合膽紅素制備成膽紅素二鈉后,再將其與鵝去氧膽酸,膽酸、氯化銨按照上述同樣濃度范圍先后溶解在 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中。上述兩種不同方法配制的組合物放置在37.5℃的環(huán)境中,分別檢測其在0,12和24小時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度。
　　

10、 結(jié)果:在37.5℃時(shí),按上述兩種方法配置的組合物中各物質(zhì)在0、24和48h性質(zhì)穩(wěn)定,濃度變化無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:所配置的組合物性質(zhì)穩(wěn)定,能夠在同一基線水平檢測生物人工肝的體外功能。
　　 第二部分
　　 目的:本研究旨在設(shè)計(jì)一種新型混合型生物人工肝,并通過對模擬肝衰竭血清的凈化作用評價(jià)其療效,探討其臨床應(yīng)用的可行性。
　　 材料和方法:整個(gè) HAL的設(shè)計(jì)采用血液灌流+生物人工肝

11、模式,非生物部分通過血漿分離后進(jìn)入血液灌流器中,經(jīng)過灌流后的血液在通過蠕動泵部分進(jìn)入生物反應(yīng)器中,生物反應(yīng)器部分置于 37.5℃的恒溫環(huán)境中,生物部分通過膜式氧合器供給反應(yīng)器中肝細(xì)胞,氧氣和二氧化碳?xì)怏w時(shí)間比約為 110:10(即 2分鐘內(nèi)通氧氣 110s,通二氧化碳 10s),模擬肝衰竭血清經(jīng)過肝細(xì)胞代謝后,在通過二次分漿回流至非生物部分,整個(gè)系統(tǒng)的預(yù)沖量約為 800ml.其中灌流型生物反應(yīng)器的預(yù)沖量約為 300ml.,整個(gè)系統(tǒng)通過兩

12、套聚乙烯膠管構(gòu)成一個(gè)封閉的環(huán)路。
　　 選用中國人肝細(xì)胞系 1(CL-1)作為肝細(xì)胞供體,采用微載體微重力肝細(xì)胞共培養(yǎng)方法培養(yǎng)至第五天,灌入反應(yīng)器中,制成生物部分(細(xì)胞總量約為4.0×109,細(xì)胞密度約為4.0×107/ml)。
　　 觀察整個(gè)治療過程中有無液體滲漏,動態(tài)監(jiān)測模擬肝衰竭血清中未結(jié)合膽紅素、鵝去氧膽酸,膽酸和血氨濃度的變化以及肝細(xì)胞對利多卡因代謝產(chǎn)物的檢測,此外每過 24h 取樣計(jì)數(shù)反應(yīng)器中肝細(xì)胞數(shù)量和肝細(xì)

13、胞的狀態(tài),MTT 法檢測肝細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果:整個(gè)治療過程中未發(fā)現(xiàn)管路中有液體滲漏；循環(huán)前 24h 內(nèi),模擬肝衰竭血清中未結(jié)合膽紅素、鵝去氧膽酸,膽酸和血氨的濃度呈直線型下降,與0h 相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),24h后濃度下降較平穩(wěn)；循環(huán) 48h 后,CL-1 細(xì)胞功能發(fā)生變化,生物反應(yīng)器中模擬肝衰竭血清中的ALT、AST 和LDH 水平明顯升高,與 0h 相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且整個(gè)反應(yīng)器中肝細(xì)胞的數(shù)

14、量和活力在循環(huán) 48h 后也呈現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1、構(gòu)建了一種新型灌流型生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器中的CL-1 細(xì)胞能夠保持較高的活性和良好的功能。
　　 2、構(gòu)建了一種新型混合生物型人工肝。該型人工肝可以顯著降低模擬肝衰竭血清中的毒性物質(zhì)的濃度,提示其具有明顯的肝支持作用。
　　 第三部分 CL-1 細(xì)胞及其細(xì)胞碎片致瘤性研究
　　 目的:探討 CL-1 細(xì)胞的安全性
　　

15、 方法:取培養(yǎng)至第五天的CL-1 細(xì)胞,以2.5g/L 胰蛋白酶消化后離心,加DMEM 調(diào)至細(xì)胞密度為 1.0×1010/L,-70℃ 反復(fù)凍溶三次,使細(xì)胞裂解,將0.2ml含細(xì)胞碎片的溶液分別接種到5只裸鼠的頸部、后背部皮下(n=10))。以0.2ml,密度為 1.0×1010/L的CL-1 細(xì)胞接種到5只裸鼠的頸部、后背部皮下(n=10),苔盤藍(lán)拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞率為 97％,作對照,觀察皮下細(xì)胞致瘤情況。4 周后切取注射部位瘤組