MN9202手性對映體對心肌細(xì)胞作用的差異性及其對內(nèi)毒素致心肌損傷的保護(hù)作用與機(jī)制.pdf

1、目的：①建立MN9202 手性固定相HPLC 拆分方法，制備單一對映體，比較MN9202 對映體對心肌細(xì)胞收縮、舒張功能及鈣瞬變的影響，及其對離子通道的立體選擇性；②探討MN9202 對心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制。為正確評價(jià)MN9202 消旋體及其對映體作用的差異性，為二氫吡啶類鈣通道拮抗劑的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 方法：①采用Daicel OJ-H 手性固定相色譜柱，通過對流動(dòng)相中正己烷與乙醇的比例、添加三乙胺的量對MN9202

2、 對映體的保留時(shí)間及分離度的影響進(jìn)行考察，優(yōu)化色譜條件，拆分MN9202 消旋體。②采用IonOptix 單細(xì)胞動(dòng)緣探測系統(tǒng)同步檢測MN9202 消旋體、S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202 作用后心肌細(xì)胞收縮、舒張和鈣瞬變的變化。③采用全細(xì)胞膜片鉗方法，比較MN9202 消旋體、S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202 對心肌細(xì)胞L 型鈣通道電流密度的影響。進(jìn)而探討各藥物對L 型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)態(tài)失

3、活動(dòng)力學(xué)特性的影響。④通過股靜脈注射LPS 建立感染性休克致動(dòng)物心肌損傷模型，研究MN9202 對心肌的保護(hù)作用；RM-6200 型四道生理記錄儀實(shí)時(shí)監(jiān)測血壓等參數(shù)；用ELISA 法測定血漿TNF-α水平；取心肌組織樣本，進(jìn)行HE 染色，比較心肌形態(tài)學(xué)改變。⑤原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，用LPS 和不同濃度的MN9202 消旋體、對映體及氨氯地平作用，采用ELISA 法測定培養(yǎng)上清液中TNF-α含量，RT-PCR 及免疫熒光法分別測定心肌

4、細(xì)胞中TNF-αmRNA 和蛋白的表達(dá)。⑥ RT-PCR 和western blot 法分別測定LPS 刺激不同時(shí)間及DHPs 作用后心肌細(xì)胞iNOS、COX-2 mRNA 和蛋白的表達(dá)。Westernblot 法測定磷酸化Akt 和總Akt 的表達(dá)。 結(jié)果: ①本研究建立的MN9202 HPLC 手性拆分條件為：Daicel OJ-H 手性分析柱，正己烷-乙醇-三乙胺（93︰7︰0.5，V︰V︰V）為流動(dòng)相，流速為0.5ml

5、/min，檢測波長為237 nm。用此法MN9202 對映異構(gòu)體可達(dá)到基線分離，并可少量制備S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202。②不同濃度的MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202 可劑量依賴性抑制大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮：在1×10-5mol/l 濃度時(shí)，百分峰值收縮幅度(PTA ％baseline)與對照組相比分別降低了73.8 ％和92.7 ％；而R-(+)-MN9202 則呈劑量依賴性增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮，1

6、×10-5 mol/l 時(shí)， PTA ％baseline 升高了18.2 ％ 。MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202 劑量依賴性抑制單個(gè)心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度（△FFI）。與對照組相比，1×10-5 mol/l MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202，細(xì)胞鈣瞬變分別由0.45±0.04 下降到0.07±0.02，及由0.45±0.04 下降到0.05±0.01（P<0.01）。而R-(+)-MN9202 則增加了鈣瞬變幅度

7、：在最大濃度1×10-5 mol/l 時(shí)，細(xì)胞鈣瞬變由0.45±0.01 升高到0.58±0.05（P<0.01）。③ MN9202 消旋體劑量依賴性的降低了L 型鈣通道電流密度。檢測電壓為0 mV，MN9202 濃度為0.03、0.1、0.3、1 和3 μmol/l 時(shí)，CaL 電流峰值的密度較對照組分別減少了6.7 ％、15.0 ％（P<0.01）、27.5 ％（P<0.01）、50.7 ％（P<0.01）和69.5 ％（P<0.0

8、1）；但藥物并未改變L 型鈣通道激活的閾電位（-40 mV）和峰值電流電位（0 mV）。S-(-)-MN9202 也抑制了L 型鈣通道電流密度，檢測電壓為0 mV 時(shí)，1 μmol/lS-(-)-MN9202 使CaL 電流峰值的密度從對照組的-9.8±1.0 減少到-3.2±0.9（減少了67 ％）（P<0.01）。而1 μmol/l R-(+)-MN9202 則引起了L 型鈣通道電流密度增加：檢測電壓為0 mV 時(shí)，使CaL 電流峰

9、值的密度從對照組的-9.3±0.7增加到-10.3±0.6（P<0.01）。MN9202 消旋體，S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202均未明顯改變L 型鈣通道的激活特性。但各藥物均對通道穩(wěn)態(tài)失活有一定的影響： MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202 均使穩(wěn)態(tài)失活曲線左移，而R-(+)-MN9202 使穩(wěn)態(tài)失活曲線輕微右移。④ LPS 在30 min 內(nèi)引起大鼠平均動(dòng)脈壓的快速下降，從119±4 降至85±2 mm

10、Hg（P<0.05）；60 min 后，大鼠平均動(dòng)脈壓仍持續(xù)下降，在240 min 時(shí)為81±3 mmHg。10 及30 μg/kg MN9202消旋體給藥后，延緩了LPS 對大鼠平均動(dòng)脈壓的下降。但MN9202 的應(yīng)用并未改變LPS 對心率的影響。給予LPS 使血漿中TNF-α的水平發(fā)生了變化，先升高，至1 小時(shí)達(dá)到峰值，而后逐漸降低。MN9202 給藥后可使LPS 引起的大鼠血漿TNF-α升高的峰值顯著降低（P<0.05）。⑤正常心

11、肌細(xì)胞幾乎不表達(dá)TNF-α，但細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量可隨LPS 濃度的增加而提高；TNF-α的釋放與mRNA 表達(dá)也隨著LPS 刺激時(shí)間的延長而顯著升高，在刺激后12 小時(shí)達(dá)高峰。0.1 ~ 10 μmol/l 的氨氯地平、MN9202 消旋體、R-(+)-MN9202 對映體可濃度依賴性的抑制LPS 刺激的TNF-α的釋放和mRNA 的表達(dá)，S-(-)-MN9202 對映體對TNF-α的釋放及mRNA 的表達(dá)無明顯影響。1.0

12、μmol/l 的氨氯地平、MN9202 消旋體、R-(+)-MN9202、S-(-)-MN9202對TNF-α釋放的抑制率分別為52.41、31.62、49.81 和2.25 ％。⑥ MN9202消旋體可濃度依賴性地抑制LPS 刺激所致iNOS 和COX-2 轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)；1.0 μmol/l 的MN9202 消旋體對COX-2 的抑制作用與氨氯地平相當(dāng)，對iNOS 的抑制作用強(qiáng)于氨氯地平；R-(+)-MN9202 明顯抑制iN

13、OS 和COX-2的表達(dá)（P<0.05），而S-(-)-MN9202 對iNOS 和COX-2 的表達(dá)均無影響。⑦LPS 刺激的同時(shí)，用MN9202 消旋體、R-(+)-MN9202 對映體或氨氯地平處理心肌細(xì)胞，均可明顯增加pAkt 的表達(dá)（P<0.05）；但S-(-)-MN9202 對Akt的活化無明顯影響。用PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預(yù)處理2 h 后，LPS 和DHPs（MN9202 消旋體、R-(

14、+)-MN9202 對映體和氨氯地平）共處理心肌細(xì)胞，各DHPs 處理組Akt 的活化均受到抑制；3 種DHPs 類化合物對TNF-α釋放的抑制作用均可被wortmannin 或LY294002 不同程度的降低；Cox-2 和iNOS 蛋白的表達(dá)與無PI3K 抑制劑預(yù)處理組相比無顯著性差異。 結(jié)論: ①本研究建立的手性固定相拆分條件為MN9202 單一對映異構(gòu)體的分離、制備及含量測定等提供了簡單、快捷的方法。②兩種MN9202

15、 對映體對心肌細(xì)胞收縮與舒張?zhí)匦?、鈣瞬變和L 型鈣通道均具有立體選擇性。S-(-)-MN9202 表現(xiàn)出了拮抗特性，而R-(+)-MN9202 則具有一定的激動(dòng)活性。③ MN9202 對LPS 致大鼠心肌損傷有保護(hù)作用，此作用與其抑制LPS 引起的TNF-α、iNOS 和COX-2 表達(dá)升高密切相關(guān)，其中R-(+)-MN9202 是抑制炎癥相關(guān)基因表達(dá)的優(yōu)映體。④ MN9202 通過激活PI3K，引起下游Akt 的活化，參與了TNF-α