蟲源性IgE依賴組胺釋放因子對Ⅰ型超敏反應性疾病的影響及其機制研究.pdf

1、研究目的: 利用基因工程技術表達宿主(大鼠)源性和寄生蟲(日本血吸蟲和華支睪吸蟲)源性IgE依賴HRF，驗證3種重組蛋白(rRttRF、rCsttRF和rSjHRF)的免疫交叉反應性，體外實驗觀察3種重組蛋白刺激宿主致敏肥大細胞釋放組胺的功能，以及抗蟲源性IgE依賴HRF的特異性抗體對宿主源性IgE依賴HRF生物學功能的影響，為蠕蟲感染影響超敏反應性疾病發(fā)生的分子機制提供實驗依據。 研究方法: 1、根據GenBa

2、nk中已知的大鼠IgE依賴HRF(RHRF)mRNA序列設計引物，以Wistar大鼠肝組織中提取的總RNA為模板，通過RT-PCR擴增RHRF‘全長cDNA序列，并通過TA克隆、藍白斑篩選和序列測定鑒定PCR產物序列是否正確；采用PCR方法分別從華支睪吸蟲成蟲cDNA質粒文庫及已構建的pGEX-4T-1-SiTCTP重組質粒中擴增CsHRF cDNA和sjHRF cDNA。 2、運用生物信息學方法對RHRF cDNA、CsHRF

3、 cDNA和sjHRF cDNA推導氨基酸序列的各級結構進行分析和比較，包括氨基酸序列同源性比較、分子進化分析、功能域預測、二級結構分析、抗原表位分析、空間構象預測等，評價三者在各級結構中的相似性。 3、將RHRF cDNA克隆至原核表達載體pET-28a(+)及pET-30a(+)：將CsHRF cDNA和SiHRF cDNA分別克隆至原核表達載體pET-30a(+)；通過PCR、雙酶切及序列測定對各重組質粒進行鑒定。

4、 4、將各重組質粒轉化大腸桿菌BL21，通過IPTG誘導，獲取原核表達的可溶性重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rsjHRF，并利用親和層析方法進行純化。 5、將純化的rCsHRF和rsjHRF分別免疫Wistar大鼠，制備免疫血清；利用Protein G樹脂通過親和層析方法分別純化2種免疫血清中的總IgG。 6、利用ELISA和Western Blotting分析重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rsjHRF的免疫交叉

5、反應性。 7、以氫氧化鋁為佐劑，用雞卵清蛋白(OVA)致敏Wistar大鼠；采用I型膠原酶和透明質酸酶消化法，對大鼠肺組織中的致敏肥大細胞進行原代分離和培養(yǎng)。 8、運用熒光分光光度法檢測3種重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF及致敏原OVA誘導致敏肥大細胞釋放組胺的劑量依賴關系，所用濃度梯度為101μg/ml，501μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml。 9、運用熒光分光光度

6、法檢測3種重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF誘導致敏肥大細胞釋放組胺與時間的關系，所觀察的反應時間分別為5min、15 min、25min、35min、45min。 10、運用熒光分光光度法檢測純化后的抗rCsHRF IgG和抗rSjHRF IgG對重組蛋白rRHRF誘導致敏肥大細胞釋放組胺的影響，每種抗體所用體積百分比濃度為1/5，2/5，3/5。 研究結果: 1、采用RT-PCR及TA克隆篩選，獲

7、得了RHRF全長cDNA，采用PCR擴增得到了CsHRF和sjHRF全長cDNA。其中RHRF cDNA全長516bp，推導氨基酸序列長172aa；CsHRF cDNA和SjHRF cDNA長度均為507 bp，推導氨基酸序列長169aa。 2、生物信息學分析表明，RHRF、CsHRF和SjHRF cDNA推導氨基酸序列的預測分子量分別為19596.4 Da，19331.0 Da，19375.7 Da，理論等電點依次為4.99，

8、5.06，4.73。多物種HRF氨基酸序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)了14個完全一致的氨基酸殘基：1(M)，11(D)，12(E)，55(E)，72(D)，79(L)，94(Y)，96(K)，144(G)，145(E)，170(P)，176(K)，182(E)，183(K)；分子進化分析顯示RHRF氨基酸序列與小鼠HRF親緣關系最近，與人HRF具有相同起源，CsHRF與SjHRF親緣關系最近，且兩者與脊椎動物HRF的親緣關系高于與無脊椎動物(果蠅

9、、蝦、秀麗桿線蟲)及單細胞惡性瘧原蟲的親緣關系，說明日本血吸蟲與華支睪吸蟲的IgE依賴HRF可能與宿主的IgE依賴HRF存在協(xié)同進化現(xiàn)象。RHRF與CsHRF氨基酸序列的一致性為43﹪，RHRF與sjHRF氨基酸序列的一致性為38﹪，CsHRF與SjHRF氨基酸序列的一致性為61﹪。三者均屬于TCTP家族(IPR001983)，含有基本相同的結構域；三者所含二級結構的類型完全相同，且各種二級結構在分子中所占比例極為相似；三者的空間構象基

10、本一致，尤其是0L螺旋區(qū)均具有保守的線性表位。 3、成功構建了RHRF、CsHRF和SjHRF cDNA的原核表達載體pET-28-rRHRF、pET-30-rRHRF、pET-30-rCsHRF及pET-30-rSjHRF，各重組蛋白均在轉化大腸桿菌BL21獲得表達，但可溶性表達水平不一，經親和層析方法獲得了純化的可溶性重組蛋白rRHeF、rCsHRF和rSjHRF。 4、ELISA和Western Blotting證實重組蛋

11、白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF三者之間存在免疫交叉反應性，且rRHRF/rCsHRF及rPHRF/rSjHRF之間的免疫交叉反應性主要由構象表位決定，線性表位介導的交叉反應較弱。 5、重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF誘導致敏肥大細胞釋放組胺具有劑量依賴關系：當重組蛋白濃度從10μg/ml上升至150μg/ml過程中，致敏肥大細胞組胺釋放率隨之上升；但當重組蛋白濃度達到200μg/ml時，部分實驗中致敏肥大

12、細胞組胺釋放率反而有所下降；rRHRF誘導致敏肥大細胞釋放組胺的能力高于rCsHRF和rSjHRV，但低于變應原OVA。 6、重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF誘導致敏肥大細胞釋放組胺的動力學曲線顯示：3種重組蛋白誘導致敏肥大細胞組胺釋放率隨著時間延長而增加，在反應開始后35min左右組胺釋放率達到最高；達到50﹪最大組胺釋放率時間約需15～20min。 7、不同濃度(1/5，2/5，3/5)的純化抗rCsH

13、RF IgG和抗rSjHRF IgG可以部分抑制重組蛋白rRHRF(75μg/ml)誘導致敏肥大細胞釋放組胺的功能，但抗體抑制作用的強弱與抗體滴度之間是否存在劑量依賴關系還需進一步驗證。 結論： 1、寄生蟲IgE依賴HRF與宿主IgE依賴HRF的氨基酸序列一致性雖然不高，但具有非常相似的空間結構，三種重組蛋白的免疫交叉反應性證實了其結構的相似性，這種交叉反應主要由抗原的構象表位決定。 2、rRHRF、rCsHRF

14、和rSjHRF誘導大鼠致敏肥大細胞釋放組胺具有劑量依賴關系，蟲源性rCsHRF和rSjHRF可以模擬宿主內源性rRHRF的生物學功能，抗蟲源性IgE依賴HRF的抗體對宿主內源性IgE依賴HRF的生物學效應具有抑制作用，提示三者可能通過相同的功能域發(fā)揮效應，具有共同的作用機制。 3、本研究初步證實了寄生性蠕蟲感染可通過釋放蟲源性IgE依賴HRF調節(jié)宿主I型超敏反應的發(fā)生發(fā)展過程，為哮喘等I型超敏反應性疾病的預防和治療