宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩和生后高蛋白飲食干預(yù)對(duì)大鼠腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響.pdf

1、宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(intratrterine growth restriction,IUGR)可通過“胎兒程序化”途徑對(duì)機(jī)體各器官功能產(chǎn)生長(zhǎng)期以至終生的影響,與成年期嚴(yán)重危害人類健康的許多疾病如高血壓、冠心病、糖尿病、慢性腎臟病等均有一定的關(guān)系。有關(guān)IUGR與腎臟疾病關(guān)系的人類研究發(fā)現(xiàn),IUGR胎兒腎臟體積較正常胎兒明顯縮小同時(shí)腎小球數(shù)目明顯減少,而生后的長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn),IUGR組腎小球?yàn)V過功能較正常組明顯降低而蛋白尿發(fā)生率明顯增高。而我科以

2、往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的資料又表明,IUGR大鼠出生時(shí)腎小球數(shù)目明顯減少,同時(shí)伴有皮質(zhì)區(qū)變薄和生腎區(qū)增厚,且生后隨訪中蛋白尿和高血壓的發(fā)生率明顯增高。但目前有關(guān)IUGR引起出生時(shí)腎小球數(shù)目減少、腎臟發(fā)育異常以及生后腎臟疾病的確切發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。
　　以往認(rèn)為,生后早期的營養(yǎng)干預(yù)尤其是高蛋白飲食對(duì)IUGR患兒體格的快速增長(zhǎng)具有一定的幫助。但近來有人提出了“預(yù)計(jì)的適應(yīng)性改變”(predictiveadaptive response,PAR)

3、的理論:胎兒可根據(jù)發(fā)育階段的環(huán)境而對(duì)生后環(huán)境進(jìn)行預(yù)計(jì),引發(fā)一系列的適應(yīng)性改變。研究顯示,宮內(nèi)營養(yǎng)不良的仔鼠如果生后飲食越豐富,其壽命越短,而我科前期有關(guān)IUGR新生仔鼠生后高蛋白飲食干預(yù)的研究發(fā)現(xiàn),高蛋白飲食不僅不能糾正生后腎小球數(shù)目的減少,反而加重了高血壓和蛋白尿的嚴(yán)重程度,但目前有關(guān)IUGR生后高蛋白飲食干預(yù)對(duì)腎臟影響的可能機(jī)理仍未完全闡明。
　　近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,它可以整體、定量、動(dòng)態(tài)地

4、研究組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)譜的變化,以及與疾病發(fā)生發(fā)展不同階段的關(guān)系,在疾病機(jī)制的研究和尋找新的藥物治療靶點(diǎn)中具有重要意義。因此,本課題通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究IUGR新生鼠與正常新生鼠腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異、IUGR成年鼠與正常成年鼠腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異以及生后高蛋白飲食干預(yù)對(duì)腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響,并進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證,以探討IUGR大鼠腎臟發(fā)育異常的可能機(jī)制、IUGR生后腎臟損害相關(guān)的關(guān)鍵蛋白分子及高蛋白飲食干預(yù)對(duì)腎臟影響的可能機(jī)理。

5、r>　　為研究IUGR新生鼠與正常新生鼠腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異,采用孕期全程低蛋白飲食法(6％低蛋白等熱卡飼料)建立IUGR大鼠模型,選擇新生鼠仔出生體重在正常對(duì)照組平均體重-2SD以下者為IUGR組。對(duì)照組以孕期常規(guī)飼料(含22％蛋白質(zhì))飼養(yǎng)至自然分娩,所生新生鼠仔作為正常對(duì)照組。8個(gè)IUGR組腎臟(平均腎重48mg±3mg,總腎重385mg)和6個(gè)正常對(duì)照組腎臟(平均腎重64mg±4mg,總腎重383mg)分別混合后抽提總蛋白,雙向

6、凝膠電泳后使用雙胺銀染法染色,凝膠圖像分析后切取組問差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)通過質(zhì)譜儀進(jìn)行肽指紋譜和串級(jí)質(zhì)譜鑒定。差異表達(dá)分析及質(zhì)譜鑒定共篩選出僅在IUGR組表達(dá)的蛋白11個(gè)(包括非特異性二肽酶、甲基丙二酸半醛脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、尿嘧啶核苷磷酸合成酶、波形蛋白、載脂蛋白A-Ⅳ、細(xì)胞角蛋白10、26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基7、δ-1-吡咯啉-5-羧化脫氫酶、視黃醇脫氫酶1、Rho GDP解離抑制因子α等),僅在正常對(duì)照組表達(dá)的蛋白1個(gè)(即剪接因子精氨酸/

7、絲氨酸豐富9);IUGR組較正常對(duì)照組表達(dá)大于5倍的蛋白7個(gè)(包括尿卟啉原脫羧酶、異質(zhì)性胞核核糖核蛋白K、75kDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白、227kDa紡錘體-著絲點(diǎn)相關(guān)蛋白、二硫化物異構(gòu)酶A3、細(xì)胞分裂蛋白激酶2、α電子轉(zhuǎn)運(yùn)黃素蛋白等),正常對(duì)照組較IUGR組表達(dá)大于5倍的蛋白2個(gè)(即γ-肌動(dòng)蛋白和串珠素)。這些差異蛋白質(zhì)主要參與能量代謝、氧化還原、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞增殖和凋亡等過程,其中結(jié)構(gòu)分子有4個(gè),包括波形蛋白、串珠素、γ-肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞

8、角蛋白10。對(duì)波形蛋白和串珠素進(jìn)一步通過western blot和免疫組化方法在腎臟組織中對(duì)其差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示波形蛋白主要表達(dá)于腎小球且IUGR組的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組,而串珠素可同時(shí)表達(dá)于腎小球和腎小管且IUGR組的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組,這一驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果相一致。
　　同時(shí),為進(jìn)一步探討IUGR成年鼠與正常成年鼠腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異以及生后高蛋白飲食干預(yù)對(duì)腎臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響,對(duì)IUGR新生鼠生后

9、分別給予常規(guī)飼料(含22％蛋白質(zhì),IUGR組)和高蛋白飼料(含30％蛋白質(zhì),高蛋白組)喂養(yǎng)直至12周齡(成年期),同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組(孕期常規(guī)飼料飼養(yǎng)至自然分娩,所生新生鼠仔生后給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)直至生后12周齡)。12周齡時(shí),每組各選取6個(gè)腎臟分別混合后抽提總蛋白,雙向凝膠電泳后使用考馬斯亮藍(lán)法染色,凝膠圖像分析后切取組間差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)通過質(zhì)譜儀進(jìn)行肽指紋譜和串級(jí)質(zhì)譜鑒定。差異表達(dá)分析及質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,共有11個(gè)

10、蛋白質(zhì)在IUGR組和高蛋白組發(fā)生了趨勢(shì)一致的表達(dá)改變,其中包括參與體內(nèi)代謝的轉(zhuǎn)酮醇酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶α1、果糖一二磷酸醛縮酶A、烏頭酸水合酶,參與氧化還原的羥酸氧化酶2、長(zhǎng)鏈特異性乙酰輔酶A脫氫酶、視黃醇脫氫酶1和谷氨酸脫氫酶1及參與轉(zhuǎn)錄和凋亡調(diào)控的α烯醇酶、α晶體蛋白和核苷二磷酸激酶B,提示這些差異蛋白質(zhì)可能參與了IUGR生后腎臟病變的發(fā)生。另有8個(gè)蛋白質(zhì)僅在高蛋白營養(yǎng)干預(yù)后出現(xiàn)差異表達(dá),其中包括參與氧化還原的異檸檬酸脫氫酶、二硫化

11、物異構(gòu)酶A3和細(xì)胞色素bcl復(fù)合物,參與凋亡調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)氯離子通道蛋白1及參與體內(nèi)代謝的GM2神經(jīng)節(jié)苷酯活化蛋白、天冬氨酸?；D(zhuǎn)移酶2、?；被崴饷?和5,10-次甲基四氫葉酸合成酶,提示這些差異蛋白質(zhì)可能參與了高蛋白飲食干預(yù)對(duì)IUGR大鼠腎臟的影響。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有2個(gè)蛋白質(zhì)即抗增殖蛋白和戴帽蛋白(肌動(dòng)蛋白絲)出現(xiàn)了等級(jí)相關(guān)的表達(dá)差異(正常對(duì)照組/IUGR組大于5倍而高蛋白組無明顯表達(dá)),提示這2個(gè)蛋白質(zhì)可能同時(shí)參與了IUGR生后腎臟

12、病變的發(fā)生及高蛋白飲食干預(yù)對(duì)腎臟的影響。對(duì)抗增殖蛋白進(jìn)一步通過western blot和免疫組化方法在腎臟組織中對(duì)其差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示抗增殖蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,IUGR組的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組而高蛋白組的表達(dá)更弱,這一驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果相一致。
　　綜上所述,能量代謝異常、氧化還原和凋亡的失衡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖的異常可能參與了IUGR大鼠腎單位數(shù)目減少和腎臟發(fā)育的異常。一些關(guān)鍵蛋白分子如谷胱甘肽S

13、轉(zhuǎn)移酶α1、α烯醇酶、核苷二磷酸激酶B、α晶體蛋白等可能參與了IUGR生后腎臟病變的發(fā)生,另一些關(guān)鍵蛋白分子如異檸檬酸脫氫酶、細(xì)胞內(nèi)氯離子通道蛋白1等可能參與了高蛋白飲食干預(yù)對(duì)IUGR者腎臟的影響,而抗增殖蛋白和戴帽蛋白(肌動(dòng)蛋白絲)則可能同時(shí)參與了IUGR生后腎臟病變的發(fā)生及高蛋白飲食干預(yù)對(duì)腎臟的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)的方法為研究IUGR腎臟發(fā)育異常和生后腎臟損害的可能機(jī)制以及探討生后高蛋白飲食干預(yù)對(duì)腎臟影響的發(fā)病機(jī)理提供了新的研究線索和思