灰葡萄孢菌和紫外誘導(dǎo)葡萄抗毒素白藜蘆醇合成及代謝的研究.pdf

1、葡萄是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水果，葡萄和葡萄酒中營(yíng)養(yǎng)成分豐富。葡萄灰霉病是葡萄生產(chǎn)和貯藏中的重要病害之一，可導(dǎo)致葡萄減產(chǎn)15％～50％左右，嚴(yán)重時(shí)甚至絕產(chǎn)。近年來(lái)，生產(chǎn)上主要防治措施為化學(xué)農(nóng)藥防治、選育抗病品種以及生物防治等，但是由于易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、耐藥性、耗時(shí)長(zhǎng)、穩(wěn)定性差以及防效低等問(wèn)題，因此通過(guò)提高葡萄自身免疫水平或鈍化或抑制病原菌的活性以抵抗病原菌為害的優(yōu)勢(shì)越發(fā)突出。
　　白藜蘆醇是葡萄遇到病原菌侵染或逆境時(shí)產(chǎn)生的

2、一類(lèi)特殊的抗毒素，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的含量與葡萄對(duì)病原菌或逆境脅迫的抗性呈正相關(guān)，因此目前白藜蘆醇被公認(rèn)為葡萄抗病程度的重要指標(biāo)之一。除白藜蘆醇外，其代謝產(chǎn)物也與葡萄抗病性有關(guān)，據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇的糖基化產(chǎn)物piceid幾乎無(wú)抗菌能力，但其氧化產(chǎn)物二聚體viniferin的抗菌能力更強(qiáng)，但是關(guān)于其代謝物viniferin的機(jī)制研究的較少。漆酶是灰霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)重要致病蛋白，具有將白藜蘆醇氧化成viniferin的能力，其漆酶的產(chǎn)量及活性與

3、灰霉菌的致病性強(qiáng)弱有關(guān)。紫外照射是誘導(dǎo)白藜蘆醇大量合成與代謝的主要方法之一，因此研究葡萄在灰霉菌和紫外誘導(dǎo)下白藜蘆醇的合成及代謝，以及灰霉菌產(chǎn)漆酶對(duì)白藜蘆醇的催化機(jī)制，對(duì)于了解葡萄抗毒素白藜蘆醇的抗病機(jī)制、灰霉菌漆酶與白藜蘆醇的互作機(jī)制、葡萄抗病品種的選育和利用以及灰霉病的防治具有一定的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究以來(lái)源于不同寄主植物的53株灰霉菌和3個(gè)葡萄品種（夏黑、巨峰和法葡）為試驗(yàn)材料，研究了不同寄主來(lái)源的灰霉菌產(chǎn)漆酶的

4、能力和酶活力，并對(duì)灰葡萄孢菌SP4菌株的生長(zhǎng)速率和致病性進(jìn)行檢測(cè)，利用HPLC分析了葡萄葉片和果實(shí)在灰葡萄孢菌SP4或紫外誘導(dǎo)下白藜蘆醇的積累情況，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了灰葡萄孢菌SP4或紫外誘導(dǎo)下葡萄抗病基因的表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)不同寄主來(lái)源的灰霉菌菌株的產(chǎn)漆酶能力及酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有菌株均具有產(chǎn)漆酶的能力，其中，以YSD2菌株產(chǎn)漆酶能力最小，SYYK112產(chǎn)漆酶能力最大。對(duì)不同菌株漆酶酶活檢測(cè)發(fā)

5、現(xiàn)，菌株YM3產(chǎn)漆酶酶活最大，而菌株YSD1酶活最小，同時(shí)，不同菌株產(chǎn)漆酶的能力與酶活無(wú)明顯相關(guān)性。其中，灰葡萄孢菌SP4菌株在培養(yǎng)20天時(shí)漆酶酶活最大，其生長(zhǎng)速度為11.8（mm/d），該菌株可引起三種葡萄葉片和果實(shí)不同程度發(fā)病。
　　(2)通過(guò)灰葡萄孢菌SP4接種和紫外處理葡萄葉片后觀察發(fā)病情況發(fā)現(xiàn)，接菌三個(gè)葡萄品種后，巨峰發(fā)病最早，病斑擴(kuò)展速度也最快，表明巨峰抗病性最差。紫外處理后，巨峰葉片損傷最大，法葡的損傷最小，表明巨峰

6、抗紫外脅迫能力較差，夏黑次之，法葡最好。
　　(3)采用HPLC檢測(cè)灰葡萄孢菌SP4誘導(dǎo)和紫外處理后三個(gè)葡萄材料葉片或果實(shí)中白藜蘆醇(Resveratrol，Res)及其代謝產(chǎn)物含量發(fā)現(xiàn)，SP4可誘導(dǎo)三個(gè)葡萄材料葉片Res及其代謝衍生物糖苷Piceid(PD)和二聚體ε-viniferin合成，不同葡萄品種中各產(chǎn)物隨接種時(shí)間變化趨勢(shì)不同，以48h或96h或168h含量最高。表明灰葡萄孢菌誘導(dǎo)葡萄葉片Res合成后主要代謝為PD和ε-

7、viniferin。同時(shí)，灰葡萄孢菌能誘導(dǎo)夏黑和巨峰果皮中Res合成，其合成量低于葉片。采用不同時(shí)間紫外誘導(dǎo)葡萄葉片后，Res、PD、PS和ε-viniferin合成量均增加，且與紫外照射時(shí)間呈正相關(guān)，其中，Res的合成量均顯著高于PD、PS和ε-viniferin，表明葡萄葉片中Res的累積是代謝合成PD、PS和ε-viniferin的前提條件。紫外誘導(dǎo)后比較不同葡萄品種各產(chǎn)物含量發(fā)現(xiàn)，Res和ε-viniferin的合成量均為:法葡

8、＞夏黑＞巨峰。比較兩種處理發(fā)現(xiàn)，紫外處理后的葉片中Res和PD合成量均顯著高于灰葡萄孢菌接菌，表明紫外照射對(duì)白藜蘆醇合成及代謝的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。同時(shí)，除法葡外，夏黑和巨峰葉片中PS的含量都顯著增加，表明PS可能是葡萄葉片在紫外誘導(dǎo)下的芪化物響應(yīng)因子。
　　(4)采用qRT-PCR法對(duì)灰葡萄孢菌SP4和紫外處理后不同葡萄抗病相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示:接菌后，夏黑和巨峰葉片中RS、STS、PAL、 MYBBF2和MYB14F基

9、因表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致:夏黑與巨峰均不表達(dá)，法葡表達(dá)先增加后減少，且在24 h或48 h時(shí)表達(dá)最大。三個(gè)葡萄材料中PGIP、PR5和PR10基因的變化趨勢(shì)一致（除巨峰葉片中PGIP基因不表達(dá)外），都為先增加后減少的表達(dá)趨勢(shì)，且PR10基因的表達(dá)量最大。紫外處理后的葉片中，除巨峰葉片中RS基因不表達(dá)和法葡葉片中MYBBF2、MYB14F和PR5基因在30min表達(dá)量達(dá)最大值外，其它抗病相關(guān)基因均呈連續(xù)增加表達(dá)的變化趨勢(shì)，在60min達(dá)最